中国水产科学 了不少的尝试,直至两峰得到良好分离。由于EF是尚需大量的实验来验证或推断,以使体外实验更具 两性物质,在流动相中易解离,对组份的保留时间和有实际意义。体外研究方法便于控制,操作简便,代 峰形都会造成不良影响,在流动相中加入四丁基溴化谢体系较纯净,易于对代谢产物进行分离提取,可以 铵,用以消除色谱柱中十八烷基键合硅胶的硅羟基对在较短的时间内得到较为明确的结果,适用于非常 EF碱性基团的吸附作用,同时将流动相pH调至3.0重要的I相代谢产物的研究,能够为药物的结构改 左右,以抑制药物解离或改变峰形 造及临床给药151提供依据 3.2研究体系的选择及药物的分离提取及检测 3.4EF在细胞中的代谢及其基础酶活模型 药物体外代谢的研究中反应体系的选择是影响 本试验中,选用鱼类常用抗菌药EF来研究其 结果准确性的首要因素,目前为止,主要用到的有亚代谢活性,不仅为该药在细胞内的代谢提供了一定 细胞结构cDNA表达的P450酶以及肝细胞和肝切的价值,而且通过测定细胞中蛋白含量后,用EF的 片等,但经过与文献[13-14比发现,由于肝细胞代谢产物CF的产量来反映酶活性的方法简单易 技术的发展,使用完整的细胞进行研究能够更加符行,是测定P450酶活性所常用的方法。关于P450 合药物在体内的代谢情况,从而更加准确地推测药酶的活性的诱导和抑制已引起医药界的关注15,建 物在体内的实际代谢,也使得肝细胞在体外代谢方立一种高效而简便的酶活性检测方法尤为重要。 面有了一定的应用。因此本实验中选用的是的优于 EF与大口黑鲈在37℃下振荡,孵育时间为 鱼的肝微粒体等亚细胞结构或其他反应体系的的肝45min,其酶活最高,因此在该条件下可选定最佳孵 细胞来研究药物代谢,更能反应真实情况。 育时间为45min。通过对酶动力学的研究发现 实验过程中曾用甲醇、乙腈或三氯醋酸直接提Vmax为0.29μg/( min mg),内在清除率Cint为 取回收率均不够理想且杂质较多。本实验最终采0.01mL/( min mg),说明该酶在大口黑鲈肝细胞中 用了二氯甲烷作为萃取剂,去除细胞中蛋白的效果的基础酶活一般,由于药物间代谢的相互作用是影响 较好且回收率变异系数等均能符合要求,且二氯甲药物在体内浓度水平的一个重要因素,因此关于 烷沸点较低(40O,极易吹干,因此二氯甲烷是较对该酶的诱导和抑制的作用有待于进一步的研究。 理想的萃取剂。另外在样品吹干后,将其浓缩2倍, 有研究初步证实EF脱乙基酶属于CYP3A亚 以降低药物在细胞中的最低检测限 家族ln,该家族的P450酶不仅可代谢一些内源性 3.3恩诺沙星在大口黑鲈肝细胞中的代谢 激素(如氢化考的松、雌激素等)和某些饮食中的有 EF与大口黑鲈肝细胞温孵后,从HPLC图上害污染物,还参与了许多环境致癌剂以及包括多种 可见EF被迅速代谢形成代谢物CF,随着时间的延常用化疗药物在内的人体中50%以上的药物代 长,EF在大口黑鲈肝细胞中呈非线性消除,与此同谢13-.因此通过对EF脱乙基酶的基础酶活模型 时其脱乙基代谢物CF呈非线性增加,当给药后的研究能够为该代谢酶所属的P450家族或亚家族 90min时,CF几乎处于饱和状态。 Intone等研作为环境毒理学的生物标志物和水域环境的指示剂 究了EF在黑鲈体内代谢及消除情况,发现在体内的研究提供一定的理论基础;另外通过该药在细胞 的代谢产物同样为CF说明代谢该药物的P450酶中代谢的研究能够了解该药在水产动物体内作用机 活性在体内外存在一致性。另外体内研究发现代理与消除规律,进而对该药的残留监控有一定的指 谢产物CF主要出现在肝脏中其次是血浆中,而皮导意义。 肤和肌肉很少出现,说明该代谢酶主要存在于肝脏 中,因此选取该酶含量较高的肝细胞作为体外实验参考文献 材料,具有一定的可操作性。EF在体外的消除半衰(1 Meyer UA. Overview of enzymes of drug metabolis.par 期为86.63h,而在体内的消除半衰期为25h,体内 消除速率常数为0.03/h,体外消除速率常数为8×(2 Steven A w, Mark v B, Barbara R. The human drug metabo- 104/h,体内外药物的消除速度存在着一定的差 lizing cytochromes P450[J]. Pharmacokinet Biopharm, 1996, 24 别,差别的存在是由于多种因素造成的如体内外环((s)46 ore L. Cecchini s. bertini s. et al pharmaco kinetics of er 境的差异、体内给药的剂量以及体外药物与细胞孵 floxacin in the sea bass( Dicentrarchus labrax)[J. Aquacul- 育时的浓度等,因此关于体内外药物代谢的相关性 ure,2000,182:49-59 c1994-2009ChinaAcademicjOurnalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp www.cnkinet了不少的尝试 ,直至两峰得到良好分离。由于 EF 是 两性物质 ,在流动相中易解离 ,对组份的保留时间和 峰形都会造成不良影响 ,在流动相中加入四丁基溴化 铵 ,用以消除色谱柱中十八烷基键合硅胶的硅羟基对 EF 碱性基团的吸附作用 ,同时将流动相 pH 调至 310 左右 ,以抑制药物解离或改变峰形。 312 研究体系的选择及药物的分离提取及检测 药物体外代谢的研究中反应体系的选择是影响 结果准确性的首要因素 ,目前为止 ,主要用到的有亚 细胞结构、cDNA 表达的 P450 酶以及肝细胞和肝切 片等 ,但经过与文献[ 13 - 14 ]比较发现 ,由于肝细胞 技术的发展 ,使用完整的细胞进行研究能够更加符 合药物在体内的代谢情况 ,从而更加准确地推测药 物在体内的实际代谢 ,也使得肝细胞在体外代谢方 面有了一定的应用。因此本实验中选用的是的优于 鱼的肝微粒体等亚细胞结构或其他反应体系的的肝 细胞来研究药物代谢 ,更能反应真实情况。 实验过程中曾用甲醇、乙腈或三氯醋酸直接提 取 ,回收率均不够理想且杂质较多。本实验最终采 用了二氯甲烷作为萃取剂 ,去除细胞中蛋白的效果 较好且回收率、变异系数等均能符合要求 ,且二氯甲 烷沸点较低 (40 ℃) ,极易吹干 ,因此二氯甲烷是较 理想的萃取剂。另外在样品吹干后 ,将其浓缩 2 倍 , 以降低药物在细胞中的最低检测限。 313 恩诺沙星在大口黑鲈肝细胞中的代谢 EF 与大口黑鲈肝细胞温孵后 ,从 HPLC 图上 可见 EF 被迅速代谢形成代谢物 CF ,随着时间的延 长 ,EF 在大口黑鲈肝细胞中呈非线性消除 ,与此同 时其脱乙基代谢物 CF 呈非线性增加 ,当给药后 90 min 时 ,CF 几乎处于饱和状态。Intorre 等[3 ]研 究了 EF 在黑鲈体内代谢及消除情况 ,发现在体内 的代谢产物同样为 CF ,说明代谢该药物的 P450 酶 活性在体内外存在一致性。另外 ,体内研究发现代 谢产物 CF 主要出现在肝脏中 ,其次是血浆中 ,而皮 肤和肌肉很少出现 ,说明该代谢酶主要存在于肝脏 中 ,因此选取该酶含量较高的肝细胞作为体外实验 材料 ,具有一定的可操作性。EF 在体外的消除半衰 期为 86163 h ,而在体内的消除半衰期为 25 h ,体内 消除速率常数为 0103/ h ,体外消除速率常数为 8 × 10 - 4 / h ,体内外药物的消除速度存在着一定的差 别 ,差别的存在是由于多种因素造成的 ,如体内外环 境的差异、体内给药的剂量以及体外药物与细胞孵 育时的浓度等 ,因此关于体内外药物代谢的相关性 尚需大量的实验来验证或推断 ,以使体外实验更具 有实际意义。体外研究方法便于控制 ,操作简便 ,代 谢体系较纯净 ,易于对代谢产物进行分离提取 ,可以 在较短的时间内得到较为明确的结果 ,适用于非常 重要的 Ⅰ相代谢产物的研究 ,能够为药物的结构改 造及临床给药[15 ]提供依据。 314 EF 在细胞中的代谢及其基础酶活模型 本试验中 ,选用鱼类常用抗菌药 EF 来研究其 代谢活性 ,不仅为该药在细胞内的代谢提供了一定 的价值 ,而且通过测定细胞中蛋白含量后 ,用 EF 的 代谢产物 CF 的产量来反映酶活性的方法简单易 行 ,是测定 P450 酶活性所常用的方法。关于 P450 酶的活性的诱导和抑制已引起医药界的关注[15 ] ,建 立一种高效而简便的酶活性检测方法尤为重要。 EF 与大口黑鲈在 37 ℃下振荡 ,孵育时间为 45 min ,其酶活最高 ,因此在该条件下可选定最佳孵 育时间为 45 min。通过对酶动力学的研究发现 Vmax 为 0129μg/ (min·mg) ,内在清除率 Clint 为 0101 mL/ (min·mg) ,说明该酶在大口黑鲈肝细胞中 的基础酶活一般 ,由于药物间代谢的相互作用是影响 药物在体内浓度水平的一个重要因素[16 ] ,因此关于 对该酶的诱导和抑制的作用有待于进一步的研究。 有研究初步证实 EF 脱乙基酶属于 CYP3A 亚 家族[17 ] ,该家族的 P450 酶不仅可代谢一些内源性 激素(如氢化考的松、雌激素等) 和某些饮食中的有 害污染物 ,还参与了许多环境致癌剂以及包括多种 常用化疗药物在内的人体中 50 %以上的药物代 谢[18 - 19 ] ,因此通过对 EF 脱乙基酶的基础酶活模型 的研究能够为该代谢酶所属的 P450 家族或亚家族 作为环境毒理学的生物标志物和水域环境的指示剂 的研究提供一定的理论基础 ;另外通过该药在细胞 中代谢的研究能够了解该药在水产动物体内作用机 理与消除规律 ,进而对该药的残留监控有一定的指 导意义。 参考文献 : [ 1 ] Meyer U A. Overview of enzymes of drug metabolism[J ]. Phar2 macokinet Biopharm ,1996 ,24 (5) :449 - 459. [ 2 ] Steven A W ,Mark V B ,Barbara J R. The human drug metabo2 lizing cytochromes P450 [J ]. Pharmacokinet Biopharm ,1996 ,24 (5) :461. [ 3 ] Intorre L ,Cecchini S ,Bertini S ,et al. Pharmacokinetics of en2 rofloxacin in the sea bass ( Dicentrarchus labrax ) [J ]. Aquacul2 ture ,2000 ,182 :49 - 59. 1008 中 国 水 产 科 学 第 14 卷