实验6组织总RNA提取 实验目的 1.了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化,如RI-PCR、 Northern blot 2.了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化,如DD-PCR、基因芯片等 3.获得某一特定组织或细胞全部mRNA,以便建立cDNA库等。 4.获得某一特定组织或细胞全部RNA 以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA 现代医学研究表明,人类的绝大多数疾病都是由若干基因表达的改变所引起的。根据 生物学“中心法则原理,基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中,由DNA到RNA的 转录过程受到各种因素的调节,其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的 调节能力。已有的硏究一再表明,中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因 的转录而实现的。 RNA主要由rRNA(占总量的80-85%),tRNA和核内小分子RNA(占总量的10-15%) 以及mRNA(占总量的1-5%)所构成。理论上认为每克组织(或108个培养细胞)可提取 5-10mg rNa 提取总RNA的方法有多种,比如 1)本实验介绍的方法,类似于本实验的 Trizol方法(今天我们会介绍这样的方法) 均称为一步法,方便而快捷。缺点是RNA的获得量偏低,质量不够纯净。 2)超离心方法,可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长,要求离 过夜 3)其它一些试剂盒,主要是利用某些特定的介质吸附RNA,驱除其它杂质,以后洗 脱纯净的RNA。可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。 原理 本实验又称异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍,抑制 RNA酶的活性,防止RNA的降解;酚/氖仿使蛋白质变性。离心后,RNA选择性地进入无 DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤等,便可得到较为完整与纯洁 的总RNA 实验准备(略) 实验步骤 (参照 GIBCO BRO公司有 Trizol试剂盒) 1.引颈处死小鼠,剖腹切取肝脏组织50mg(或105-107个细胞),加入1 ml trizol液 剪碎,快速匀浆 2.22℃,静置5min 3.加入氯仿0.2m,颠倒15s。 4.22℃,静置3min。 5.离心:4℃×15000转/分×15min 6.取上清液0.5ml。 7.加入0.5m异丙醇,混匀 8.22℃,静置10min 9.离心:4℃×15000转/分×10min 0.弃上液。实验 6 组织总 RNA 提取 实验目的 1．了解某一特定组织或细胞某一特定 mRNA 转录量的变化，如 RT-PCR、Northern blot 等。 2．了解某一特定组织或细胞全部 mRNA 转录量的变化，如 DD-PCR、基因芯片等。 3．获得某一特定组织或细胞全部 mRNA，以便建立 cDNA 库等。 4．获得某一特定组织或细胞全部 RNA。 以上工作的前提是制备纯净且完整的 RNA。 现代医学研究表明，人类的绝大多数疾病都是由若干基因表达的改变所引起的。根据 生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中，由 DNA 到 RNA 的 转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的 调节能力。已有的研究一再表明，中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因 的转录而实现的。 RNA 主要由 rRNA（占总量的 80-85％），tRNA 和核内小分子 RNA（占总量的 10-15％） 以及 mRNA（占总量的 1-5％）所构成。理论上认为每克组织（或 108 个培养细胞）可提取 5-10mg RNA。 提取总 RNA 的方法有多种，比如： 1）本实验介绍的方法，类似于本实验的 Trizol 方法（今天我们会介绍这样的方法）， 均称为一步法，方便而快捷。缺点是 RNA 的获得量偏低，质量不够纯净。 2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的 RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心 过夜。 3）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附 RNA，驱除其它杂质，以后洗 脱纯净的 RNA。可以在短时间内获得纯净的 RNA。但是价格比较昂贵。 原 理 本实验又称异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。方法采用强 RNA 酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制 RNA 酶的活性，防止 RNA 的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA 选择性地进入无 DNA 和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁 的总 RNA。 实验准备（略） 实验步骤 （参照 GIBCO BRC 公司有 Trizol 试剂盒） 1．引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织 50mg（或 106 -107 个细胞），加入 1ml Trizol 液， 剪碎，快速匀浆。 2．22℃，静置 5min。 3．加入氯仿 0.2ml，颠倒 15s。 4．22℃，静置 3min。 5．离心：4℃×15000 转/分×15min。 6．取上清液 0.5ml。 7．加入 0.5ml 异丙醇，混匀。 8．22℃，静置 10min。 9．离心：4℃×15000 转/分×10min。 10．弃上液