白质含量,按242克/升加入细粉状固体硫酸铵,使溶液达到0.4饱和度,放置数小时 后,抽滤,弃去滤饼,滤液按250克/升加入研细的硫酸铵,使溶液饱度达到0.75, 放置数小时,抽滤,弃去滤液,滤饼(粗胰蛋白酶)溶解后进行结晶:按每克滤饼溶于 l. Oml ph9.0的04M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液,小心搅拌溶解,取样后,用2M NaOH调pH至8.0,注意要小心调节,偏酸不易结晶,偏碱易失活,存放于冰箱。 放置数小时后,应出现大量絮状物,溶液逐渐变稠呈胶态,再加入总体积的1/4 1/5的pH80的0.2M硼酸缓冲液,使胶态分散,必要时加入少许胰蛋白酶晶体。 放置2~5天可得到大量胰蛋白酶结晶,每天观察,核对pH是否为80并及时调整 用显微镜观察,待结晶析出完全时,抽滤,母液回收,一次结晶的胰蛋白酶产物再进行 重结晶:用约1倍的0.025MHC,使上述结晶分散,加入约10~1.5倍体积的pH90的 0.8M硼酸缓冲液,至结晶酶全部溶解,取样后,用2 MNaOh调溶液pH至80(淮确) (体积过大,很难结晶),冰箱放置1~2天,可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母 液回收),冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。 2.胰蛋白酶活性的测定 (1)紫外法测定酶溶液的蛋白质含量 在280mm测得蛋白质溶液的吸光度,除以该蛋白质的比消光系数,即可算出该蛋白 质溶液的浓度(mg/ml) 少量氯化钠、硫酸铵、磷酸盐、硼酸盐和τris等无明显干扰作用。紫外法操作简便、 快速,适合于制备过程中进行监测 测定时将待测酶液用0.0MHCl稀至适当浓度,以0.001MHCl1作对照 猪胰蛋白酶在280m的比消光系数为:E%1cm=13.5,所以当其浓度为1mgml时 消光系数应为1.35。 胰蛋白酶的蛋白含量(mgm)=A280×稀释倍数13 ()胰蛋白酶活力的测定(BAEE法):参见亲和层析实验 五、注意事项 1.胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的,否则可能因组织自溶而导致 实验失败 2.在室温14~20℃条件下8~12小时可激活完全,激活时间过长,因酶本身自溶 而会使比活降低,比活性达到“3000~4000BAEE单位/mg蛋白”时即可停止激活 3.要想获得胰蛋白酶结晶,在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作,切勿粗 心大意,前几步的分离纯化效果愈好,则培养结晶也较容易,因此每一步操作都要严格 酶蛋白溶液过稀难形成结晶,过浓则易形成无定形沉淀析出,因此,必需恰到好处, 般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。 4.过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化,必须严格控制PH 5.第一次结晶时,3~5天后仍然无结晶,应检査pH,必要时调整pH或接种,促 使结晶形成。重结晶时间要短些246 白质含量，按 242 克/升 加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到 0.4 饱和度，放置数小时 后，抽滤，弃去滤饼，滤液按 250 克/升 加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到 0.75， 放置数小时，抽滤，弃去滤液，滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于 1.0ml pH9.0 的 0.4M 硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解，取样后，用 2M NaOH 调 pH 至 8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。 放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的 1/4～ 1/5 的 pH8.0 的 0.2M 硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。 放置 2～5 天可得到大量胰蛋白酶结晶，每天观察，核对 pH 是否为 8.0 并及时调整。 用显微镜观察，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收，一次结晶的胰蛋白酶产物再进行 重结晶：用约 1 倍的 0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约 1.0～1.5 倍体积的 pH9.0 的 0.8M 硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用 2M NaOH 调溶液 pH 至 8.0（准确） （体积过大，很难结晶），冰箱放置 1～2 天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母 液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。 2. 胰蛋白酶活性的测定 ⑴ 紫外法测定酶溶液的蛋白质含量 在 280nm 测得蛋白质溶液的吸光度，除以该蛋白质的比消光系数，即可算出该蛋白 质溶液的浓度（mg/ml）。 少量氯化钠、硫酸铵、磷酸盐、硼酸盐和 Tris 等无明显干扰作用。紫外法操作简便、 快速，适合于制备过程中进行监测。 测定时将待测酶液用 0.001M HCl 稀至适当浓度，以 0.001M HCl 作对照。 猪胰蛋白酶在 280nm 的比消光系数为：E 1% 1cm=13.5 ，所以当其浓度为 1mg/ml 时， 消光系数应为 1.35。 胰蛋白酶的蛋白含量(mg/ml)＝ A280×稀释倍数/1.35 ⑵ 胰蛋白酶活力的测定（BAEE 法）：参见亲和层析实验。 五、注意事项 1. 胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的，否则可能因组织自溶而导致 实验失败。 2. 在室温 14～20℃条件下 8～12 小时可激活完全，激活时间过长，因酶本身自溶 而会使比活降低， 比活性达到“3000～4000BAEE 单位/mg 蛋白” 时即可停止激活。 3. 要想获得胰蛋白酶结晶，在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作，切勿粗 心大意，前几步的分离纯化效果愈好，则培养结晶也较容易，因此每一步操作都要严格。 酶蛋白溶液过稀难形成结晶，过浓则易形成无定形沉淀析出，因此，必需恰到好处，一 般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。 4. 过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格控制 PH。 5. 第一次结晶时，3～5 天后仍然无结晶，应检查 pH，必要时调整 pH 或接种，促 使结晶形成。重结晶时间要短些