分析化学 第40卷 体中后,促进了氧气接受电子生成活性氧物质(ROS),因而氧气的还原峰电化学信号随之增强。 Shkil 等叫直接将表面过量表达细胞色素氧化酶b2( Flavocytochrome b2,FCb2)的酵母细胞 Hansenula poly morpha固定在电极表面对L-乳酸呼吸进行体外模拟电化学研究。结果表明,由于细胞表面过量表达的 FC促进了L-乳酸呼吸代谢,因此氧气的还原电流随着乳酸的加入而逐渐下降 基于蛋白膜伏安法的研究基础,研究者制备了多种具有良好生物相容性的膜材料,并将细胞固定到 电极表面,进行电分析化学研究巴明。不同于传统的蛋白膜伏安法,Meng等叫提出了一种借助转染技术 将细胞固定在固体界面(金电极)的普适方法,并据此对细胞内物质进行了电化学分析探讨(如图1所 示)。依据外源DNA在Ca2+存在的条件下可以通过转染进入细胞体内的原理,在1moCa2存在的 条件下,293T细胞通过转染固定到巯基DNA修饰的金电极表面。此时,作为细胞固定工具的巯基DNA 又可作为电子传递的通道,促进细胞内的电活性物质和电极表面的电子传递。在该研究中,作为细胞染 色试剂的亚甲基蓝分子以及与细胞预培养的中药分子山奈酚均以巯基DNA为导线,随着细胞的固定与 电极发生电子传递产生相应的电化学信号。因此,该研究以核酸分子作为固定细胞的材料以及电子传 递通道,实现了细胞在电极界面的固定并得到胞内活性物质的电化学信号,使细胞内部物质的电化学分 析成为可能。基于上述细胞固定的方法,Liu等四提出了一种新颖的活细胞检测电化学手段。在Ca2+ 存在的条件下,人肝癌SMMC-7721细胞通过转染固定到电极表面,将DNA末端的二茂铁分子包含在细 胞内部,抑制了二茂铁与电极的电子传递,峰电流随着细胞浓度的增加而下降,可以在细胞浓度为 00~10°cel/mnL范围内线性检测细胞。 了-DNA 3细胞凋亡的电化学分析 细胞凋亡的失调与多种疾病密切相关,如 阿兹海默症、各种肿瘤、艾滋病以及自身免疫 病等叫n,因此细胞调亡的检测不仅有助于5:5 @0 提高病程判断的准确性,更可以作为治疗干预 效果判断的早期标志 图1金电极表面组装293T细胞及胞内活性物质通过电极表 在早期凋亡的细胞中,磷脂酰丝氨酸会从面固定的DNA与电极进行电子传递的示意图叫 细胞质膜的内侧翻转到外侧,从而暴露在细胞 Fig. I Illustration of the assembly of293 T cells on a gold elec-- 外表面。因此,以Ca2依赖性磷脂结合蛋 trode surface and the electric communication between the electro- 白——膜联蛋白( Annexin v)作为探针特异 active species inside the cells and the electrode via the transfected 性地识别细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸是细 surface-immobilized DNA 胞凋亡检测最常用的手段之一吗明。Tong等通过电极表面的金纳米颗粒层将膜联蛋白Ⅴ固定在电极 表面。随后,表面暴露有大量磷脂酰丝氨酸的早期凋亡细胞通过和膜联蛋白V紧密结合固定在电极表 面,阻碍了溶液中铁氰化钾分子与电极的电子传递,增加了电极表面的阻抗值。Liu等凹以聚乙醇胺作 为膜材料将膜联蛋白Ⅴ固定在电极表面用以识别和结合早期凋亡细胞。研究表明,凋亡的A549细胞 固定在电极表面以后,大大降低了电化学探针二氯化五氨合氯钌与电极之间的电子传递速率,导致了二 氯化五氨合氯钌峰电流值下降。同时,膜联蛋白V的功能促进剂Ca2可以有效地提高细胞凋亡电化 分析的效率 半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶( Cysteine-dependent aspartate-specific proteinases, Caspases)是在活 细胞和细胞裂解液中检测凋亡的重要标记物。其中, Caspase-3作为最重要的细胞凋亡执行者,可以特 异性切割含有 Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)序列的底物多肽四。Xiao等基于细胞裂解液中 Caspase-3酶 活性检测提出了一种细胞凋亡检测的电化学方案。电极表面底物多肽末端的二茂铁分子发生氧化还 原反应可以产生电化学信号。当凋亡细胞裂解液中含有的大量 Caspase3特异性识别并切割多肽底物 后,二茂铁分子远离电极,失去电化学响应。 Zhang等以碳纳米管为信号放大的载体,通过层层组装 技术在其表面共修饰链霉亲和素和量子点作为电化学信号探针(如图2所示)。当探针通过与底物多肽 末端的生物素结合固定到电极表面后,利用阳极溶出伏安法可以检测到碳纳米管探针中镉的溶出信号。体中后,促进了氧气接受电子生成活性氧物质(ROS),因而氧气的还原峰电化学信号随之增强。Shkil 等[11]直接将表面过量表达细胞色素氧化酶 b2 (Flavocytochrome b2,FC b2)的酵母细胞 Hansenula poly￾morpha 固定在电极表面对 L-乳酸呼吸进行体外模拟电化学研究。结果表明,由于细胞表面过量表达的 FC 促进了 L-乳酸呼吸代谢,因此氧气的还原电流随着乳酸的加入而逐渐下降。 基于蛋白膜伏安法的研究基础,研究者制备了多种具有良好生物相容性的膜材料,并将细胞固定到 电极表面,进行电分析化学研究[12,13]。不同于传统的蛋白膜伏安法,Meng 等[14]提出了一种借助转染技术 将细胞固定在固体界面(金电极)的普适方法,并据此对细胞内物质进行了电化学分析探讨(如图 1 所 示)。依据外源 DNA 在 Ca 2+ 存在的条件下可以通过转染进入细胞体内的原理,在 1 mol/L Ca 2+ 存在的 条件下,293T 细胞通过转染固定到巯基 DNA 修饰的金电极表面。此时,作为细胞固定工具的巯基 DNA 又可作为电子传递的通道,促进细胞内的电活性物质和电极表面的电子传递。在该研究中,作为细胞染 色试剂的亚甲基蓝分子以及与细胞预培养的中药分子山奈酚均以巯基 DNA 为导线,随着细胞的固定与 电极发生电子传递产生相应的电化学信号。因此,该研究以核酸分子作为固定细胞的材料以及电子传 递通道,实现了细胞在电极界面的固定并得到胞内活性物质的电化学信号,使细胞内部物质的电化学分 析成为可能。基于上述细胞固定的方法,Liu 等[15]提出了一种新颖的活细胞检测电化学手段。在 Ca 2+ 存在的条件下,人肝癌 SMMC-7721 细胞通过转染固定到电极表面,将 DNA 末端的二茂铁分子包含在细 胞内部,抑制了二茂铁与电极的电子传递,峰电流随着细胞浓度的增加而下降,可以在细胞浓度为 图 1 金电极表面组装 293T 细胞及胞内活性物质通过电极表 面固定的 DNA 与电极进行电子传递的示意图[14] Fig.1 Illustration of the assembly of 293T cells on a gold elec￾trode surface and the electric communication between the electro￾active species inside the cells and the electrode via the transfected surface-immobilized DNA [14] 500~10 6 cell/mL 范围内线性检测细胞。 3 细胞凋亡的电化学分析 细胞凋亡的失调与多种疾病密切相关,如 阿兹海默症、各种肿瘤、艾滋病以及自身免疫 病等[16,17]。因此,细胞凋亡的检测不仅有助于 提高病程判断的准确性,更可以作为治疗干预 效果判断的早期标志。 在早期凋亡的细胞中,磷脂酰丝氨酸会从 细胞质膜的内侧翻转到外侧,从而暴露在细胞 外表 面。 因 此,以 Ca 2+ 依 赖 性 磷 脂 结 合 蛋 白———膜联蛋白 V(Annexin V)作为探针特异 性地识别细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸是细 胞凋亡检测最常用的手段之一[18,19]。Tong 等[20]通过电极表面的金纳米颗粒层将膜联蛋白 V 固定在电极 表面。随后,表面暴露有大量磷脂酰丝氨酸的早期凋亡细胞通过和膜联蛋白 V 紧密结合固定在电极表 面,阻碍了溶液中铁氰化钾分子与电极的电子传递,增加了电极表面的阻抗值。Liu 等[21]以聚乙醇胺作 为膜材料将膜联蛋白 V 固定在电极表面用以识别和结合早期凋亡细胞。研究表明,凋亡的 A549 细胞 固定在电极表面以后,大大降低了电化学探针二氯化五氨合氯钌与电极之间的电子传递速率,导致了二 氯化五氨合氯钌峰电流值下降。同时,膜联蛋白 V 的功能促进剂 Ca 2+ 可以有效地提高细胞凋亡电化学 分析的效率。 半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Cysteine-dependent aspartate-specific proteinases,Caspases)是在活 细胞和细胞裂解液中检测凋亡的重要标记物。其中,Caspase-3 作为最重要的细胞凋亡执行者,可以特 异性切割含有 Asp-Glu-Va-l Asp (DEVD)序列的底物多肽[22]。Xiao 等[23]基于细胞裂解液中 Caspase-3 酶 活性检测,提出了一种细胞凋亡检测的电化学方案。电极表面底物多肽末端的二茂铁分子发生氧化还 原反应可以产生电化学信号。当凋亡细胞裂解液中含有的大量 Caspase-3 特异性识别并切割多肽底物 后,二茂铁分子远离电极,失去电化学响应。Zhang 等[24]以碳纳米管为信号放大的载体,通过层层组装 技术在其表面共修饰链霉亲和素和量子点作为电化学信号探针(如图 2 所示)。当探针通过与底物多肽 末端的生物素结合固定到电极表面后,利用阳极溶出伏安法可以检测到碳纳米管探针中镉的溶出信号。 分 析 化 学 第 40 卷