多重PCR具有普通PCR的特异性和灵敏度，同时更具高效性、系统性、简便经济性。但是多重PCR存在 敏感性较低、扩增效率不高、扩增条件需要摸索与协调和引物间干扰等不足。 (三)荧光PCR检测技术 目前荧光PCR所使用的荧光化学方法主要有4种，分别为DNA结合染色、水解探针、分子信标和杂交探 针。这3种荧光PCR检测技术的步骤基本相同，主要包括：①设计并合成荧光PCR引物采用荧光PCR引物设 计软件设计相应的荧光引物并送与基因合成公司合成。②样品DNA的提取DNA提取方法如前所述。③PCR 反应的优化引物溶解后，使用统计学方法对DNA聚合酶以及反应体系进行PCR反应的优化。④制备标准 曲线样品需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线， 以此作为进行相对定量的标准。⑤标样和待检样品的荧光PC扩增标准曲线样品和待测样品分别加入到 含荧光PCR反应液中进行荧光PCR扩增和检测。⑥检测结果分析根据绘制的标准曲线，对待测样品的目的 基因进行定量分析。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差， 所得结果代表某样品的目的基因相对含量。⑦提供实验报告包括详细的实验方法及实时荧光定量PC实 验结果的相关图表。 实时荧光定量PCR实现了核酸检测的快速性，其荧光探针标记特定核酸的方法使准确性更高，使用 更少的样本量并且在约1h获得结果，简化了传统PC方法和试验步骤。但也存在容易受核酸污染影响等问 题。 (四)基因芯片技术 基因芯片是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然 后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特 定微生物。 基因芯片的基本操作步骤可简述如下：①样品制备和标记样品先提取、纯化样品核酸并进行扩增， 然后采用体外转录、PCR和逆转录等方法进行标记。这样可以弥补荧光检测系统的灵敏度还不够高，并且 提高检测灵敏度。②杂交反应在合适的反应条件下，靶基因与芯片上的探针进行碱基互补形成稳定的双 链，未杂交的其它核酸分子随后被洗去。③信号检测和结果分析在杂交反应完成后，将芯片插入扫描仪 中，对片基进行激光共聚焦显微扫描，样品核酸上标记的荧光分子受激发出荧光，用带滤光片镜头采集每 一点的荧光，经光电倍增管(PWT)或电荷偶合元件(CCD)转换成电信号，计算机软件将电信号转换为数值， 并同时将数值的大小用不同的颜色在屏幕上直观地表示出来。 基因芯片的突出特点为高度的并行性、多样化、微型化和自动化。在病原微生物的检测方面更具特色， 可以在一张芯片上同时对多种病原菌进行自动化快速检测，使用样品量极少降低了试剂的消耗，特异性 及灵敏度较高，有助于在黄金时间为临床医师对疾病的诊断治疗提供依据 1010 多重PCR具有普通PCR的特异性和灵敏度,同时更具高效性、系统性、简便经济性。但是多重PCR存在 敏感性较低、扩增效率不高、扩增条件需要摸索与协调和引物间干扰等不足。 （三）荧光PCR检测技术 目前荧光PCR所使用的荧光化学方法主要有4种，分别为DNA结合染色、水解探针、分子信标和杂交探 针。这3种荧光PCR检测技术的步骤基本相同，主要包括：①设计并合成荧光PCR引物 采用荧光PCR引物设 计软件设计相应的荧光引物并送与基因合成公司合成。②样品DNA的提取 DNA提取方法如前所述。③PCR 反应的优化 引物溶解后，使用统计学方法对DNA聚合酶以及反应体系进行PCR反应的优化。④ 制备标准 曲线样品 需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线， 以此作为进行相对定量的标准。⑤标样和待检样品的荧光PCR扩增 标准曲线样品和待测样品分别加入到 含荧光PCR反应液中进行荧光PCR扩增和检测。⑥检测结果分析 根据绘制的标准曲线，对待测样品的目的 基因进行定量分析。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差， 所得结果代表某样品的目的基因相对含量。⑦提供实验报告 包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实 验结果的相关图表。 实时荧光定量PCR 实现了核酸检测的快速性, 其荧光探针标记特定核酸的方法使准确性更高, 使用 更少的样本量并且在约1 h获得结果, 简化了传统PCR方法和试验步骤。但也存在容易受核酸污染影响等问 题。 （四）基因芯片技术 基因芯片是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然 后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特 定微生物。 基因芯片的基本操作步骤可简述如下：①样品制备和标记 样品先提取、纯化样品核酸并进行扩增， 然后采用体外转录、PCR和逆转录等方法进行标记。这样可以弥补荧光检测系统的灵敏度还不够高，并且 提高检测灵敏度。②杂交反应 在合适的反应条件下，靶基因与芯片上的探针进行碱基互补形成稳定的双 链，未杂交的其它核酸分子随后被洗去。③信号检测和结果分析 在杂交反应完成后，将芯片插入扫描仪 中，对片基进行激光共聚焦显微扫描，样品核酸上标记的荧光分子受激发出荧光，用带滤光片镜头采集每 一点的荧光，经光电倍增管(PMT)或电荷偶合元件(CCD)转换成电信号，计算机软件将电信号转换为数值， 并同时将数值的大小用不同的颜色在屏幕上直观地表示出来。 基因芯片的突出特点为高度的并行性、多样化、微型化和自动化。在病原微生物的检测方面更具特色, 可以在一张芯片上同时对多种病原菌进行自动化快速检测, 使用样品量极少降低了试剂的消耗, 特异性 及灵敏度较高, 有助于在黄金时间为临床医师对疾病的诊断治疗提供依据