第5期 吕乐等：乳酸菌USTB08的高效培养和生产乳酸 ·603 厌氧培养过程中通过流加碱进行pH值的恒定控 养量30L,控制pH值的流加液组成为10%氢氧化 制，可以缓解pH值过低对乳酸菌生长和产乳酸带 钠和25%蔗糖混合溶液，pH值控制在6.0~7.0之 来的不利影响，但初始底物糖类浓度过高也会在一 间的任何一个恒定值.实验开始后每4取样分别 定程度上抑制乳酸菌的生长.Kadam和靳志强 测定ODm和乳酸含量（测定方法参照文献 等团发现，菌体浓度随初糖浓度的增大而增加，但 00]) 过高的底物浓度反而抑制了细胞的快速增殖.因 2结果与讨论 此，是否能保持培养体系pH值的恒定，同时又能维 持一定的糖类浓度是培养乳酸菌厌氧发酵成败的 2.1批量培养不同碳源对乳酸菌生长的效应 关键. 乳酸菌一般可以利用葡萄糖等多种单糖及一些 本文在成功筛选出一株乳酸菌的基础上，重点 简单寡糖作为碳源.图1显示，与葡萄糖、甘油和糖 围绕乳酸菌的批量和流加培养控制条件的优化进行 蜜相比，蔗糖是支持乳酸菌快速生长的最优碳源，培 了研究.首次采用10%氢氧化钠和25%蔗糖作为 养4d后，其0D6s0m可达1.5.虽然糖蜜中含有蔗糖 控制pH值和糖类的流加液，在成功控制pH值恒定 成分，但能够支持乳酸菌生长的碳源不足，培养4d 的同时流加蔗糖以支持乳酸菌的快速生长和乳酸的 后ODom仅为1.0左右.葡萄糖虽然也可以作为支 高产，本研究对高效培养乳酸菌和发酵生产乳酸具 持乳酸菌生长的碳源，但较蔗糖和糖蜜差，而甘油基 有非常重要的研究意义和应用价值 本不能作为支持乳酸菌生长的碳源.与蔗糖相比， 葡萄糖属于单糖最容易被乳酸菌利用，但在其代谢 1材料与方法 过程中产酸速度较快，从而导致培养基pH值的快 1.1菌种 速降低，因此不适于乳酸菌的快速培养：糖蜜中虽然 本实验所用的乳酸菌是从北京市延庆县妫水湖 含有蔗糖和少量还原糖，但由于糖蜜成分复杂，含有 岸边泥土中分离纯化得到，依据《常见细菌系统鉴 部分有害的无机和有机化合物，阻碍乳酸菌的生长， 定手册》网鉴定为乳酸菌，命名为乳酸菌USTB-O8. 影响乳酸的积累，因此也不适于乳酸菌的培养.谷 1.2培养基 长维)和熊晓辉等回研究发现：麦芽糖和乳糖的 根据文献9]配制批量培养基，其中碳源选择 质量比为1：1是乳酸菌生长的最优碳源。熊涛等围 蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜：氮源选择酵母膏、蛋白 研究发现葡萄糖质量分数为5%时，乳酸菌 胨、尿素和硝酸钾.通过不同碳氮源批量培养的优 NUCO1O1的菌体浓度最高.本文研究发现乳酸菌 化组合实验，确定流加培养的碳源和氮源组成 USTB-08适宜生长的碳源为蔗糖 1.3研究方法 1.6 1.3.1批量培养碳源和氮源的选择与优化 1.4 ◆蔗糖士葡糖 1.2 ■甘油X糖蜜 选择蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜四种含碳有机物 分别作为碳源，采用酵母膏、蛋白胨、尿素和硝酸钾 1.0 四种含氮化合物分别作为氮源.通过不同条件组合 0.6 的实验，研究确定批量培养乳酸菌的优化碳源、氮源 0.4 和碳氮比.碳源按照总有机碳为4g·L的量分别 0.2 加入，氮源按照总氯0.4g·Lˉ的初始质量浓度分别 3 加入.培养基和所用器皿均经过121℃下20min的 时间d 高温高压灭菌后使用 图1不同碳源对乳酸菌USTB08生长的效应 1.3.2批量培养控制条件优化 Fig.1 Effects of different carbon sources on the growth of Lactobacil- 在100mL三角瓶中进行密闭厌氧培养，研究了 lus sp.USTB-08 不同培养温度和接种量对乳酸菌生长的效应.实验 开始后，每天取样在722S型分光光度计上测定光密 2.2不同氨源对乳酸菌生长的效应 度(OD6om)以示乳酸菌的生长. 乳酸菌营养要求复杂，正常生长除了需要碳源、 1.3.3控制pH值同步流加碳源的培养实验 氮源和无机盐外，还需要氨基酸和维生素等生长因 依据批量培养优化的条件，在50L全自控发酵 子.图2显示，与硝酸钾、尿素和蛋白胨相比，酵母 罐中进行恒定控制pH值同步流加碳源的实验，培 音是支持乳酸菌快速生长的最优氮源，培养4d后，第 5 期 吕 乐等: 乳酸菌 USTB--08 的高效培养和生产乳酸 厌氧培养过程中通过流加碱进行 pH 值的恒定控 制，可以缓解 pH 值过低对乳酸菌生长和产乳酸带 来的不利影响，但初始底物糖类浓度过高也会在一 定程度上抑制乳酸菌的生长． Kadam［6］和靳志强 等［7］发现，菌体浓度随初糖浓度的增大而增加，但 过高的底物浓度反而抑制了细胞的快速增殖． 因 此，是否能保持培养体系 pH 值的恒定，同时又能维 持一定的糖类浓度是培养乳酸菌厌氧发酵成败的 关键． 本文在成功筛选出一株乳酸菌的基础上，重点 围绕乳酸菌的批量和流加培养控制条件的优化进行 了研究． 首次采用 10% 氢氧化钠和 25% 蔗糖作为 控制 pH 值和糖类的流加液，在成功控制 pH 值恒定 的同时流加蔗糖以支持乳酸菌的快速生长和乳酸的 高产，本研究对高效培养乳酸菌和发酵生产乳酸具 有非常重要的研究意义和应用价值． 1 材料与方法 1. 1 菌种 本实验所用的乳酸菌是从北京市延庆县妫水湖 岸边泥土中分离纯化得到，依据《常见细菌系统鉴 定手册》［8］鉴定为乳酸菌，命名为乳酸菌 USTB--08． 1. 2 培养基 根据文献［9］配制批量培养基，其中碳源选择 蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜; 氮源选择酵母膏、蛋白 胨、尿素和硝酸钾． 通过不同碳氮源批量培养的优 化组合实验，确定流加培养的碳源和氮源组成． 1. 3 研究方法 1. 3. 1 批量培养碳源和氮源的选择与优化 选择蔗糖、葡萄糖、甘油和糖蜜四种含碳有机物 分别作为碳源，采用酵母膏、蛋白胨、尿素和硝酸钾 四种含氮化合物分别作为氮源． 通过不同条件组合 的实验，研究确定批量培养乳酸菌的优化碳源、氮源 和碳氮比． 碳源按照总有机碳为 4 g·L － 1 的量分别 加入，氮源按照总氮 0. 4 g·L － 1 的初始质量浓度分别 加入． 培养基和所用器皿均经过 121 ℃ 下 20 min 的 高温高压灭菌后使用． 1. 3. 2 批量培养控制条件优化 在 100 mL 三角瓶中进行密闭厌氧培养，研究了 不同培养温度和接种量对乳酸菌生长的效应． 实验 开始后，每天取样在 722S 型分光光度计上测定光密 度( OD680 nm ) 以示乳酸菌的生长． 1. 3. 3 控制 pH 值同步流加碳源的培养实验 依据批量培养优化的条件，在 50 L 全自控发酵 罐中进行恒定控制 pH 值同步流加碳源的实验，培 养量 30 L，控制 pH 值的流加液组成为 10% 氢氧化 钠和 25% 蔗糖混合溶液，pH 值控制在 6. 0 ～ 7. 0 之 间的任何一个恒定值． 实验开始后每 4 h 取样分别 测定 OD680 nm 和 乳 酸 含 量 ( 测定方法参照文献 ［10］) ． 2 结果与讨论 2. 1 批量培养不同碳源对乳酸菌生长的效应 乳酸菌一般可以利用葡萄糖等多种单糖及一些 简单寡糖作为碳源． 图 1 显示，与葡萄糖、甘油和糖 蜜相比，蔗糖是支持乳酸菌快速生长的最优碳源，培 养 4 d 后，其 OD680 nm可达 1. 5． 虽然糖蜜中含有蔗糖 成分，但能够支持乳酸菌生长的碳源不足，培养 4 d 后 OD680 nm仅为 1. 0 左右． 葡萄糖虽然也可以作为支 持乳酸菌生长的碳源，但较蔗糖和糖蜜差，而甘油基 本不能作为支持乳酸菌生长的碳源． 与蔗糖相比， 葡萄糖属于单糖最容易被乳酸菌利用，但在其代谢 过程中产酸速度较快，从而导致培养基 pH 值的快 速降低，因此不适于乳酸菌的快速培养; 糖蜜中虽然 含有蔗糖和少量还原糖，但由于糖蜜成分复杂，含有 部分有害的无机和有机化合物，阻碍乳酸菌的生长， 影响乳酸的积累，因此也不适于乳酸菌的培养． 谷 长维［11］和熊晓辉等［12］研究发现: 麦芽糖和乳糖的 质量比为 1∶ 1是乳酸菌生长的最优碳源． 熊涛等［13］ 研究 发 现 葡 萄 糖 质 量 分 数 为 5% 时，乳 酸 菌 NUC0101 的菌体浓度最高． 本文研究发现乳酸菌 USTB--08 适宜生长的碳源为蔗糖． 图 1 不同碳源对乳酸菌 USTB--08 生长的效应 Fig． 1 Effects of different carbon sources on the growth of Lactobacil￾lus sp． USTB-08 2. 2 不同氮源对乳酸菌生长的效应 乳酸菌营养要求复杂，正常生长除了需要碳源、 氮源和无机盐外，还需要氨基酸和维生素等生长因 子． 图 2 显示，与硝酸钾、尿素和蛋白胨相比，酵母 膏是支持乳酸菌快速生长的最优氮源，培养 4 d 后， ·603·