、双缩脲法( Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3 CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到 的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有 两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都 有双缩脲反应。 H2O IN------------NH CH-R C=O --NH R-CH CH-R 12O 紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无 关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要 有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主 要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测 (二)试剂与器材 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成 l0mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度lmg/ml的A2为0.66来校正其纯度。如有 需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据 其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制,酪蛋白 用0.05 NAoh配制 (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4·5HO)和60克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6·4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液, 用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若 贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。 2.器材172 二、双缩脲法（Biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经 180℃左右加热，放出一个分子氨后得到 的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有 两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都 有双缩脲反应。 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无 关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要 有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主 要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测 定。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用 BSA 浓度 1mg/ml 的 A280 为 0.66 来校正其纯度。如有 需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据 其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制，酪蛋白 用 0．05N NaOH 配制。 （2）双缩脲试剂：称以 1.50 克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和 6.0 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6·4H2O），用 500 毫升水溶解，在搅拌下加入 300 毫升 10% NaOH 溶液， 用水稀释到 1 升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若 贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2. 器材：