当样品液加入到层析柱时,核苷酸就可以与离子交换树脂相结合。洗脱时,通过改变pH 值或增加洗脱液中竞争性离子的强度,使被吸附的核苷酸的相应电荷降低,与树脂的亲 和力降低,结果使核苷酸得到分离。 混合核苷酸可以用阳离子或阴离子交换树脂进行分离。采用阳离子交换时,控制样 品液pH值在15,此时UMP带负电,而AMP、CMP、GMP带正电,可被阳离子树脂 吸附。然后通过逐渐升高pH值,将各核甘酸洗脱下来,次序是UMP- GMP-CMP-AMP。 AMP与CMP洗脱位置的互换,是由于聚苯乙烯树脂母体对嘌呤碱基的非极性吸附力大 于对嘧啶碱基的吸附力造成的。 本实验采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季铵碱型粉末阴离子树脂(201×8)分离四 种核苷酸首先使RNA碱水解液中的其它离子强度降至002以下,然后调pl值至6以 上,使样品核苷酸都带上负电荷,它们都能与阴离子交换树脂结合。结合能力的强弱 与核苷酸的pl值有关,pl越大,与阴离子交换树脂的结合力越弱,洗脱时越易交 换下来。由表1可见,当用含竞争性离子的洗脱液进行洗脱时,洗脱下来的次序应该是 CMP、AMP、GMP和UMP。由于本实验所用的树脂的不溶性基质是非极性的,它与嘌 呤碱基的非极性亲和力大于与嘧啶碱基的非极性亲和力。所以,实际洗脱下来的次序为 CMP、AMP、UMP和GMP。对于同一种核甘酸的不同异构体而言,它们之间的差别仅 在于磷酸基位于核糖的不同位置上,2-一磷酸基较3—磷酸基距离碱基更近,因而它的 负电性对碱基正电荷的电中和影响较大,其pK值也较大。例如2-胞苷酸的pK1=44 3-胞苷酸的pK1=4.3,因此2一核苷酸更易被洗脱下来。 应注意的是,样品不易过浓,洗脱的流速不宜过快,洗脱液的pH值要严格控制 否则将使吸附不完全,洗脱峰平坦而使各核苷酸分离不清。 3.核苷酸的鉴定 由于核苷酸中都含有嘌呤与嘧啶碱基,这些碱基都具有共轭双键(-C=CC=C ),它能够强烈地吸收250~280毫微米波段的紫外光,而且有特征的紫外吸收比值 因此,通过测定各洗脱峰溶液在220~300毫微米波长范围内的紫外吸收值,作出紫外吸 收光谱图,与下图所示的标准吸收光谱进行比较,并根据其吸光度比值(250nm/260nm, 280nm/26onm,290nm/260m)以及最大吸收峰与下页“表2”所列标准值比较后,即可 判断各组分为何种核苷酸。 根据各组分在其最大吸收波长(mx)处总的吸光度(总Amax)以及相应的摩尔消 光系数(E260m),可以计算出RNA中四种核苷酸的微摩尔数和碱基摩尔数百分组成。215 当样品液加入到层析柱时，核苷酸就可以与离子交换树脂相结合。洗脱时，通过改变 pH 值或增加洗脱液中竞争性离子的强度，使被吸附的核苷酸的相应电荷降低，与树脂的亲 和力降低，结果使核苷酸得到分离。 混合核苷酸可以用阳离子或阴离子交换树脂进行分离。采用阳离子交换时，控制样 品液 pH 值在 1.5，此时 UMP 带负电，而 AMP、CMP、GMP 带正电，可被阳离子树脂 吸附。然后通过逐渐升高 pH 值，将各核甘酸洗脱下来，次序是 UMP-GMP-CMP-AMP。 AMP 与 CMP 洗脱位置的互换，是由于聚苯乙烯树脂母体对嘌呤碱基的非极性吸附力大 于对嘧啶碱基的吸附力造成的。 本实验采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季铵碱型粉末阴离子树脂（201×8）分离四 种核苷酸.首先使 RNA 碱水解液中的其它离子强度降至 0.02 以下，然后调 pH 值至 6 以 上，使样品核苷酸都带上负电荷，它们都能与阴离子交换树脂结合。结合能力的强弱， 与核苷酸的 pI 值有关，pI 越大，与阴离子交换树脂的结合力越 弱，洗脱时越易交 换下来。由表 1 可见，当用含竞争性离子的洗脱液进行洗脱时，洗脱下来的次序应该是 CMP、AMP、GMP 和 UMP。由于本实验所用的树脂的不溶性基质是非极性的,它与嘌 呤碱基的非极性亲和力大于与嘧啶碱基的非极性亲和力。所以，实际洗脱下来的次序为： CMP、AMP、UMP 和 GMP。对于同一种核甘酸的不同异构体而言，它们之间的差别仅 在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2'—磷酸基较 3'—磷酸基距离碱基更近，因而它的 负电性对碱基正电荷的电中和影响较大,其 pK 值也较大。例如 2'-胞苷酸的 pK1=4.4 ， 3'-胞苷酸的 pK1 = 4.3 ，因此 2'一核苷酸更易被洗脱下来。 应注意的是，样品不易过浓，洗脱的流速不宜过快，洗脱液的 pH 值要严格控制。 否则将使吸附不完全，洗脱峰平坦而使各核苷酸分离不清。 3. 核苷酸的鉴定 由于核苷酸中都含有嘌呤与嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键（—C=C—C=C —），它能够强烈地吸收 250~280 毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。 因此，通过测定各洗脱峰溶液在 220~300 毫微米波长范围内的紫外吸收值，作出紫外吸 收光谱图，与下图所示的标准吸收光谱进行比较，并根据其吸光度比值（250nm/260nm, 280nm/260nm, 290nm/260nm）以及最大吸收峰与下页“表 2”所列标准值比较后，即可 判断各组分为何种核苷酸。 根据各组分在其最大吸收波长（max）处总的吸光度（总 Amax ）以及相应的摩尔消 光系数（E260 nm）, 可以计算出 RNA 中四种核苷酸的微摩尔数和碱基摩尔数百分组成