是,时常会碰到两条引物的Tm值不一致,或PCR反复调整仍不见改善,此时可以考虑 Touch Down Pcr的方法,具体参见本书 RACE PCR介绍。 7.CG丰富的DNA模版往往不容易扩增,对此,可以采用DMSO( DIMETHYL SULFOXIDE),用量为PCR反应总容积的1/10。比如将4u的DMSO加入36u的PCR反 应液,使总容积达40ul 8.MgCl2。通常 PCR buffer中含有MgC2,但是由于一些不清楚的原因,有时仍嫌不 足,此时可以适当增加MgCl2的浓度 9.PCR是一种十分灵敏的实验,对操作技巧要求高,为防止加样误差,建议做复管 同时,同时进行多个反应时,相同的试剂建议先一道配置,并留有余量,比如Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP、消毒过的双蒸水等,混匀,这样可以很大程度上避免上样误差。 10.关于电泳参见本书实验29。 11.关于试管。为提高PCR的质量,以及大批量PCR反应的操作,目前业已开发出 不同的PCR试管。比如为减少管壁导热的延滞,发展出超薄壁的PCR试管:为满足批量实 验,发展出排状PCR试管,等等。我们在实验中先后使用过一些不同的试管,从操作方便 和安全上看仍喜欢采用0.5ml的试管。这样的试管比较结实,不宜引起试管的破裂和同位素 的泄漏,且手持起来方便。 实验4点突变PCR 点突变PCR的使用机会越来越多了起来。当研究发现中医药对某些特定基因的具有调 整作用以后,自然要求深入了解实现对该基因调整的具体途径,比如中医药对某基因的调整 是直接的,并通过这样的调整发挥疗效,抑或是间接的;如果这些基因的功能尚不清楚,那 么,哪些部位是主要的功能区,改变了这些功能区会如何:在这些基因中中医药可能对启动 子的哪些部位发生作用,等等,点突变PCR技术可以为回答这些疑问提供方便。 本方法是利用PCR技术,改变目的基因的个别或若干碱基,使该碱基所处位置的基因 功能发生变化,以观察其意义。例如对于功能基因,可以检测点突变后功能是否发生变化, 以逐步明确功能区的意义;或直接破坏一些已明确的功能区,使该基因失去原有功能:或用 于筛选启动子中的重要序列、增强子的位置,了解一些已知转录调控蛋白及其特定结合序列 的关系,等等。 点突变PCR技术的实现主要有两种方法,一种是比较老的办法,叫做两步法点突变 PCR;另一种发展比较晩,并得益于Taq酶性能的提高,称之为一步法点突变PCR。如 STRATAGENE公司 Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit所采用的一步法点突变PCR。 原理 采用性能优良的DNA聚合酶 PfuTurbo DNa polymerase,设计出含有突变位点的一对 对应的引物,将含有目的基因的载体加热解链,退火时,突变引物会结合到载体插入片段的 相应序列上,并以此作为引物,延伸。该方法可以直接完成数千bp长度的含有插入片段的 整个载体的复制,使复制的DNA含有突变位点。PCR后,PCR产物用DpnI消化原先的模 版,这是因为大多来自于大肠杆菌的DNA是甲基化的,对DpnI敏感,而新延伸的DNA 链则不然。消化后,所消化的质粒未突变链含有大量的切口,在转化大肠杆菌后,大肠杆菌 会依据突变链将切口修补完善,并予以复制。从而完成基因的点突变。由于该技术仅使用 次PCR循环,所以被称为一步法点突变PCR 实验5DNA双脱氧链终止法测序 目的 1.了解目的DNA的序列,如获得的 DDPCR片段。发现中医药改变了某一不明的 mRNA转录水平,而且反转录得到了该mRNA的cDNA,欲观察该cDNA的序列;通过基 因cDNA库的筛选得到基因的全部序列,要求完成测序 2.了解目的基因是否发生了突变、缺失。例如经中医药治疗或处理后是否可以阻止 或纠正病变组织基因组的突变 3.一些实验如 Footprint要求在足迹电泳的一侧有DNA的序列,以明确核蛋白所结合 启动子的区域 鉴定某一基因是否为目的基因。是，时常会碰到两条引物的 Tm 值不一致，或 PCR 反复调整仍不见改善，此时可以考虑 Touch Down PCR 的方法，具体参见本书 RACE PCR 介绍。 7．CG 丰富的 DNA 模版往往不容易扩增，对此，可以采用 DMSO（DIMETHYL SULFOXIDE），用量为 PCR 反应总容积的 1/10。比如将 4ul 的 DMSO 加入 36ul 的 PCR 反 应液，使总容积达 40ul。 8．MgCl2。通常 PCR buffer 中含有 MgCl2，但是由于一些不清楚的原因，有时仍嫌不 足，此时可以适当增加 MgCl2 的浓度。 9．PCR 是一种十分灵敏的实验，对操作技巧要求高，为防止加样误差，建议做复管。 同时，同时进行多个反应时，相同的试剂建议先一道配置，并留有余量，比如 Taq 酶、10×PCR Buffer、dNTP、消毒过的双蒸水等，混匀，这样可以很大程度上避免上样误差。 10．关于电泳参见本书实验 29。 11．关于试管。为提高 PCR 的质量，以及大批量 PCR 反应的操作，目前业已开发出 不同的 PCR 试管。比如为减少管壁导热的延滞，发展出超薄壁的 PCR 试管；为满足批量实 验，发展出排状 PCR 试管，等等。我们在实验中先后使用过一些不同的试管，从操作方便 和安全上看仍喜欢采用 0.5ml 的试管。这样的试管比较结实，不宜引起试管的破裂和同位素 的泄漏，且手持起来方便。 实验 4 点突变 PCR 点突变 PCR 的使用机会越来越多了起来。当研究发现中医药对某些特定基因的具有调 整作用以后，自然要求深入了解实现对该基因调整的具体途径，比如中医药对某基因的调整 是直接的，并通过这样的调整发挥疗效，抑或是间接的；如果这些基因的功能尚不清楚，那 么，哪些部位是主要的功能区，改变了这些功能区会如何；在这些基因中中医药可能对启动 子的哪些部位发生作用，等等，点突变 PCR 技术可以为回答这些疑问提供方便。 本方法是利用 PCR 技术，改变目的基因的个别或若干碱基，使该碱基所处位置的基因 功能发生变化，以观察其意义。例如对于功能基因，可以检测点突变后功能是否发生变化， 以逐步明确功能区的意义；或直接破坏一些已明确的功能区，使该基因失去原有功能；或用 于筛选启动子中的重要序列、增强子的位置，了解一些已知转录调控蛋白及其特定结合序列 的关系，等等。 点突变 PCR 技术的实现主要有两种方法，一种是比较老的办法，叫做两步法点突变 PCR；另一种发展比较晚，并得益于 Taq 酶性能的提高，称之为一步法点突变 PCR。如 STRATAGENE 公司 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所采用的一步法点突变 PCR。 原理 采用性能优良的 DNA 聚合酶 PfuTurbo DNA polymerase，设计出含有突变位点的一对 对应的引物，将含有目的基因的载体加热解链，退火时，突变引物会结合到载体插入片段的 相应序列上，并以此作为引物，延伸。该方法可以直接完成数千 bp 长度的含有插入片段的 整个载体的复制，使复制的 DNA 含有突变位点。PCR 后，PCR 产物用 Dpn I 消化原先的模 版，这是因为大多来自于大肠杆菌的 DNA 是甲基化的，对 Dpn I 敏感，而新延伸的 DNA 链则不然。消化后，所消化的质粒未突变链含有大量的切口，在转化大肠杆菌后，大肠杆菌 会依据突变链将切口修补完善，并予以复制。从而完成基因的点突变。由于该技术仅使用一 次 PCR 循环，所以被称为一步法点突变 PCR。 实验 5 DNA 双脱氧链终止法测序 目的 1．了解目的 DNA 的序列，如获得的 DDPCR 片段。发现中医药改变了某一不明的 mRNA 转录水平，而且反转录得到了该 mRNA 的 cDNA，欲观察该 cDNA 的序列；通过基 因 cDNA 库的筛选得到基因的全部序列，要求完成测序。 2．了解目的基因是否发生了突变、缺失。例如经中医药治疗或处理后是否可以阻止 或纠正病变组织基因组的突变。 3．一些实验如 Footprint 要求在足迹电泳的一侧有 DNA 的序列，以明确核蛋白所结合 启动子的区域。 鉴定某一基因是否为目的基因