第4期李杰等植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 钙高pH法、PEG法等后来相继发展了PEG与高a2+、高pH值相结合的方法(也简称PEG 法)、电融合法以及聚集微束激光法.目前广泛使用的是PEG法和电融合法.PEG法是采用 聚乙二醇为融合剂的一种化学方法,使用简便、经济、可重复性强,已成功使近百个实验获得 体细胞杂种.PEG法诱导原生质体融合时,一般所用分子量为1500~6000,浓度为15%~ 45%.PEG法的缺点是处理时间、PEG分子量、诱导液的浓度等不易掌握,且易形成多元融合 物还有待于完善.电场融合是目前最流行的物理诱导融合法,它是20世纪80年代初迅速 崛起的一种细胞融合技术.近年来,已发表了数百篇关于电融合的基本化学机理及其在 医学分子生物学、生物技术学等方面应用的科学论文.迄今为止,通过电融合反复实验,已 测出了数十种植物原生质体的电融合参数,如水稻、小麦、燕麦( Arena sativa L)、马铃薯 ( Solanum tuberous)油菜(B. campesinos)、胡萝卜( Daucus carota)、菜豆( Phaseolus vu ganis)、蚕 豆烟草矮牵牛等,并成功获得部分细胞杂种.原生质体在融合液中的接触和融合受到 外电场的作用强度、融合液的组成(如渗透剂种类、Ca2+Mg2浓度添加的化学物质pH值 等)的影响.电场融合的最适条件,需要分别具体材料,在实验中不斷加以探索而提高,但电 融合因其操作简便、快速、融合同步性好,尤其是与微培养技术相结合,将会是非常有前途的 技术体系.在融合的方式上,主要有对称融合和供体-受体式融合两种.对称融合是体细胞 杂交最初采用的融合方法,并由之实现了许多有性杂交不亲和的种属间的基因交流.如在 马铃薯的育种中Mhej等用对称融合的方法获得了产量提高的四倍体细胞杂种,开辟 了马铃薯商业化育种的新途径.但一般来说,对称融合在导入有用基因的同时,也带入新的 全部不利基因,同时在体细胞水平上,也往往表现出一定程度的种间不亲和性.供体-受体 式融合可分为细胞质杂交和不对称融合.若用致死剂量的射线处理供体原生质体,则可以 形成完全没有亲本染色体的胞质杂种,若利用ⅹ射线、紫外线打断或破坏亲本一方完整的染 色体结构,使染色体部分被破坏后用于体细胞杂交,则形成不对称体细胞杂种.供体-受体 式融合,可以实现胞质基因的重组,更有希望克服远缘杂交的不亲和性,因而是一条育种的 简便途径,但不足之处在于供体基因丢失是一个随机的过程,丢失的程度是不可预见和难以 控制的所以有针对地转移特定的性状是亟待解决的问题 2.2植物体细胞的杂交组合 20世纪70年代,在培育体细胞杂种方面所取得的巨大成功使人们极度兴奋,许多学者 直致力于用这一方法创造新的杂种在早期的研究中,研究兴趣和重点集中于获得亲缘 关系较远的植物之间的体细胞杂种,在许多系统发育上无关的种间进行了大量的原生质体 融合实验.有关例子包括大豆和烟草、大豆和大麦( Hordeum vulgare)、大豆和玉米、大豆和油 菜、胡萝卜和大麦、胡萝卜和芹菜(ApⅧmgwnεol)等.多数情况下这些实验都如意料中的 样失败,融合的产物几乎不能进行分裂和生长.随后,许多学者试图从同科异属的杂种细 胞再生杂种植物杂交组合的例子有番茄+马铃薯、拟南芥+油菜、颠茄(Amp郫p.)+曼陀 罗( Datura spp.)等,且获得了一些稳定的杂种细胞品系,有的还成功地再生出属间杂种植 物,如广为宣传的番茄+马铃薯杂交植株.20世纪80年代中期以来,人们研究的兴趣转向 选用近缘种内或种间以及较近缘属间的杂交组合.近缘体细胞杂交,具有更强的目的性,并 且在实践上已经证明是一条可行的育种途径.在此期间,随着一大批经济植物如水稻、大 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://wnww.cnki.net钙高 pH 法、PEG法等 ,后来相继发展了 PEG与高 Ca2 + 、高 pH 值相结合的方法 (也简称 PEG 法) 、电融合法以及聚集微束激光法. 目前 ,广泛使用的是 PEG法和电融合法. PEG法是采用 聚乙二醇为融合剂的一种化学方法 ,使用简便、经济、可重复性强 ,已成功使近百个实验获得 体细胞杂种. PEG法诱导原生质体融合时 ,一般所用分子量为1 500～6 000 ,浓度为 15 %～ 45 %. PEG法的缺点是处理时间、PEG分子量、诱导液的浓度等不易掌握 ,且易形成多元融合 物 ,还有待于完善. 电场融合是目前最流行的物理诱导融合法 ,它是 20 世纪 80 年代初迅速 崛起的一种细胞融合技术[9 ] . 近年来 ,已发表了数百篇关于电融合的基本化学机理及其在 医学、分子生物学、生物技术学等方面应用的科学论文. 迄今为止 ,通过电融合反复实验 ,已 测出了数十种植物原生质体的电融合参数 ,如水稻、小麦、燕麦 (Avena sativa L) 、马铃薯 ( Solanum tuberousm) 、油菜( B . campestris) 、胡萝卜( Daucus carota) 、菜豆( Phaseolus vulgaris) 、蚕 豆、烟草、矮牵牛等 ,并成功获得部分细胞杂种[10 ] . 原生质体在融合液中的接触和融合受到 外电场的作用强度、融合液的组成(如渗透剂种类、Ca2 + ,Mg2 + 浓度、添加的化学物质、pH 值 等) 的影响. 电场融合的最适条件 ,需要分别具体材料 ,在实验中不断加以探索而提高 ,但电 融合因其操作简便、快速、融合同步性好 ,尤其是与微培养技术相结合 ,将会是非常有前途的 技术体系. 在融合的方式上 ,主要有对称融合和供体 - 受体式融合两种. 对称融合是体细胞 杂交最初采用的融合方法 ,并由之实现了许多有性杂交不亲和的种属间的基因交流. 如在 马铃薯的育种中 ,Mattheij 等[11 ]用对称融合的方法获得了产量提高的四倍体细胞杂种 ,开辟 了马铃薯商业化育种的新途径. 但一般来说 ,对称融合在导入有用基因的同时 ,也带入新的 全部不利基因 ,同时在体细胞水平上 ,也往往表现出一定程度的种间不亲和性. 供体 - 受体 式融合可分为细胞质杂交和不对称融合. 若用致死剂量的射线处理供体原生质体 ,则可以 形成完全没有亲本染色体的胞质杂种 ,若利用 X射线、紫外线打断或破坏亲本一方完整的染 色体结构 ,使染色体部分被破坏后用于体细胞杂交 ,则形成不对称体细胞杂种. 供体 - 受体 式融合 ,可以实现胞质基因的重组 ,更有希望克服远缘杂交的不亲和性 ,因而是一条育种的 简便途径 ,但不足之处在于供体基因丢失是一个随机的过程 ,丢失的程度是不可预见和难以 控制的 ,所以有针对地转移特定的性状是亟待解决的问题. 212 植物体细胞的杂交组合 20 世纪 70 年代 ,在培育体细胞杂种方面所取得的巨大成功使人们极度兴奋 ,许多学者 一直致力于用这一方法创造新的杂种. 在早期的研究中 ,研究兴趣和重点集中于获得亲缘 关系较远的植物之间的体细胞杂种 ,在许多系统发育上无关的种间进行了大量的原生质体 融合实验. 有关例子包括大豆和烟草、大豆和大麦( Hordeum vulgare) 、大豆和玉米、大豆和油 菜、胡萝卜和大麦、胡萝卜和芹菜 ( Apium graveolens) 等. 多数情况下这些实验都如意料中的 一样失败 ,融合的产物几乎不能进行分裂和生长. 随后 ,许多学者试图从同科异属的杂种细 胞再生杂种植物 ,杂交组合的例子有番茄 + 马铃薯、拟南芥 + 油菜、颠茄(Atropa spp. ) + 曼陀 罗( Datura spp. ) 等 ,且获得了一些稳定的杂种细胞品系 ,有的还成功地再生出属间杂种植 物 ,如广为宣传的番茄 + 马铃薯杂交植株. 20 世纪 80 年代中期以来 ,人们研究的兴趣转向 选用近缘种内或种间以及较近缘属间的杂交组合. 近缘体细胞杂交 ,具有更强的目的性 ,并 且在实践上已经证明是一条可行的育种途径. 在此期间 ,随着一大批经济植物如水稻、大 第 4 期 李 杰 ,等 :植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 76 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net