第14卷第6期 中国水产科学 Vol 14 2007年11月 Journal of fishery sciences of china November 大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定 王翔凌杨先乐12,林茂3喻文娟',张宁,张书俊 (1.上海水产大学农业部渔业动植物病原库,上海200090;2.上海高校水产养殖学E研究院,上海200090;3.集美大学水 产学院,福建厦门361021) 摘要:建立了反相高效液相色谱法检测大口黑鲈( Micropterus salmoides)原代肝细胞中恩诺沙星( rofloxacin,EF)代谢 情况的方法,并通过其代谢产物环丙沙星 Cinrofloxacin,CF)来间接反映恩诺沙星N·脱乙基酶的活性。采用二氯甲烷 提取细胞中的药物,正己烷脂,反相高效液相色谱法测定其中的药物浓度。经测得该方法样品回收率均大于 80.28%,日间变异系数小于5.54%,通过EF与大口黑鲈肝细胞进行孵育,发现EF在细胞中的消除方程为C 50e000°,消除半衰期(T2)为86.63h,消除速率常数(K为8×104/h。对孵育过程中的酶活研究发现最佳孵育时 间为45mn,其酶活性为0.25ug/( min mg),酶动力学参数中最大反应速率(m)为0.29ug( min img),米氏常数(Kn) 为22.37μg/mL,内在清除率(clm)为0.01mL/( min .mg)。结果表明,该酶与底物结合力不强,酶促反应强度较弱,EF 在大口黑鲈肝细胞中的代谢较缓慢。[中国水产科学,2007,14(6):1004-1009] 关键词:大口黑鲈;,肝细胞;恩诺沙星;反相高效液相色谱法;消除;酶活 中图分类号:S94 文献标识码:A 文章编号:1005-8737(2007)06·1004·06 细胞色素P450是肝微粒体混合功能氧化酶中诺酮类药物,由于其广谱抗菌特性,曾在兽医和水产 最重要的一族在外源性和内源性物质代谢中起着上得到了广泛的应用51。目前该药由于其残留问 极其重要的作用1-21。恩诺沙星( Enrofloxacin,EF)题,在有些水产动物体内已被禁用,因此关于该药在 的代谢反应为典型的P450酶代谢反应,代谢酶水产动物体内的代谢及消除问题已经引起了人们的 为N脱乙基酶,其主要活性代谢产物为环丙沙星重视。 ( Ciprofloxacin,CF)(图1)14。EF作为第三代氟喹 EF(Mw3594) CF(Mw331.3) 图1EF的氧化脱乙基 Fig. 1 Oxidative deet hylation of EF 目前对药物残留问题的研究主要是通过其在动定P450酶活性的报道多数是以肝微粒体为反应体 物体内的代谢情况来反应,EF在家禽、家畜以及海系8,但用靶动物大口黑鲈的肝细胞进行药物代 水鲈体内的代谢研究已有报道3-6,而在体外研究谢的研究尚未见报道。在细胞中研究药物代谢及相 EF的代谢及其代谢酶的活性从而能够省时经济地关酶活能够排除体内各种因素对该研究的影响,全 反应药物的残留状况目前尚未见报道。有关体外测面真实地反应药物代谢,因此本实验用反相高效 收稿日期:2007-04-21;修订日期2007-07-20 基金项目:国家自然科学基金项目(30371109);上海市教委E-研究院建设资助项目(E03009);上海市重点学科建设资助项目(Y01) 作者简介:王翔凌(1979-),女,博士研究生,主要从事水产动物疾病与药理学研究.Te:021-65710870,Emal: nancywxl@eyou.om 通讯作者杨先乐.e:021-65710503;Emal:xiyang@shu.edu.cn 1994-2009ChinaAcademicJOunalElectronicpUblishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net大口黑鲈肝细胞中恩诺沙星的消除及其代谢酶活性的测定 王翔凌 ,杨先乐1 ,2 ,林茂3 ,喻文娟1 ,张宁1 ,张书俊1 (11 上海水产大学农业部渔业动植物病原库 ,上海 200090 ; 21 上海高校水产养殖学 E2研究院 ,上海 200090 ; 31 集美大学水 产学院 ,福建 厦门 361021) 摘要 :建立了反相高效液相色谱法检测大口黑鲈 ( Micropterus salmoides) 原代肝细胞中恩诺沙星 ( Enrofloxacin , EF) 代谢 情况的方法 ,并通过其代谢产物环丙沙星(Ciprofloxacin ,CF) 来间接反映恩诺沙星 N - 脱乙基酶的活性。采用二氯甲烷 提取细胞中的药物 ,正己烷去脂 ,反相高效液相色谱法测定其中的药物浓度。经测得该方法样品回收率均大于 80128 % ,日间变异系数小于 5154 %。通过 EF 与大口黑鲈肝细胞进行孵育 ,发现 EF 在细胞中的消除方程为 C = 50e - 01000 8 t ,消除半衰期( T1/ 2 ) 为 86163 h ,消除速率常数( K) 为 8 ×10 - 4 / h。对孵育过程中的酶活研究发现最佳孵育时 间为 45 min ,其酶活性为 0125μg/ (min·mg) ,酶动力学参数中最大反应速率( V max ) 为 0129μg/ (min·mg) ,米氏常数( Km) 为 22137μg/ mL ,内在清除率( Clint ) 为 0101 mL/ (min·mg) 。结果表明 ,该酶与底物结合力不强 ,酶促反应强度较弱 , EF 在大口黑鲈肝细胞中的代谢较缓慢。[中国水产科学 ,2007 ,14 (6) :1 004 - 1 009 ] 关键词 :大口黑鲈 ;肝细胞 ;恩诺沙星 ;反相高效液相色谱法 ;消除 ;酶活 中图分类号 :S94 文献标识码 :A 文章编号 :1005 - 8737 - (2007) 06 - 1004 - 06 收稿日期 :2007 - 04 - 21 ; 修订日期 :2007 - 07 - 20. 基金项目 :国家自然科学基金项目(30371109) ;上海市教委 E - 研究院建设资助项目( E03009) ;上海市重点学科建设资助项目( Y1101) . 作者简介 :王翔凌(1979 - ) ,女 ,博士研究生 ,主要从事水产动物疾病与药理学研究. Tel :021 - 65710870 ,E2mail :nancywxl @eyou. com 通讯作者 :杨先乐. Tel :021 - 65710503 ; E2mail :xlyang @shfu. edu. cn 细胞色素 P450 是肝微粒体混合功能氧化酶中 最重要的一族 ,在外源性和内源性物质代谢中起着 极其重要的作用[1 - 2 ] 。恩诺沙星( Enrofloxacin ,EF) 的代谢反应为典型的 P450 酶代谢反应[3 ] ,代谢酶 为 N2脱乙基酶 ,其主要活性代谢产物为环丙沙星 (Ciprofloxacin ,CF) (图 1) [4 ] 。EF 作为第三代氟喹 诺酮类药物 ,由于其广谱抗菌特性 ,曾在兽医和水产 上得到了广泛的应用[5 ] 。目前该药由于其残留问 题 ,在有些水产动物体内已被禁用 ,因此关于该药在 水产动物体内的代谢及消除问题已经引起了人们的 重视。 图 1 EF 的氧化脱乙基 Fig11 Oxidative deethylation of EF 目前对药物残留问题的研究主要是通过其在动 物体内的代谢情况来反应 , EF 在家禽、家畜以及海 水鲈体内的代谢研究已有报道[3 - 6 ] ,而在体外研究 EF 的代谢及其代谢酶的活性从而能够省时经济地 反应药物的残留状况目前尚未见报道。有关体外测 定 P450 酶活性的报道多数是以肝微粒体为反应体 系[7 - 8 ] ,但用靶动物大口黑鲈的肝细胞进行药物代 谢的研究尚未见报道。在细胞中研究药物代谢及相 关酶活能够排除体内各种因素对该研究的影响 ,全 面真实地反应药物代谢 ,因此本实验采用反相高效 第 14 卷第 6 期 2 0 0 7 年 1 1 月 中 国 水 产 科 学 Journal of Fishery Sciences of China Vol. 14 No. 6 November 2007