同济大学学报(医学版) 第41卷 因的保留和过表达),E5蛋白作为癌蛋白也参与在控制病毒早期启动子方面具有抑制功能。当E2 了HPV感染细胞癌变的过程。 蛋白浓度低时,E2将优先与启动子远端2个E2BS 2.1 HPV DNA在宿主细胞中的整合 结合,导致早期病毒蛋白E6、E7的产生增加。随着 近年来有研究表明,多数HPV感染是一过性E2蛋白浓度的增加,相对于启动子远端的2个 的,一般在感染后6~12个月通过机体免疫系统作E2BS,更多E2蛋白将与启动子近端的2个E2BS 用会转阴,但当机体免疫力下降或DNA发生突变结合,通过置换结合位点的特异性蛋白1( specificity 后,部分亚型 HPV DNA可随机与感染细胞基因组 protein1,Spl)和TATA结合蛋白( TATA-binding 发生整合使细胞周期调节系统失控。因此,从宿主 protein,TBP)使E6、E7的转录受抑制。另一方 细胞感染HPV发展至宫颈癌, HPV DNA随机整合面,E2可以与HPV复制过程中的解旋酶相互作用 到人类基因组中这一步骤必不可少。在人类促进DNA复制。如2.1所提及,HPV的致癌过程 基因组中, HPV DNA可以与人类基因组中的各个与HPV病毒与宿主基因组整合密不可分,而与宿主 DNA开放阅读框发生随机整合,但其中与结构不稳基因组整合后,E2基因铰链区是最常见的缺失或断 定的染色体(如3q28、4q13.3、8q24.21、13q22.1和裂部位,因此整合后的宿主细胞内E2蛋白的表达 17q21或mRNA簇附近)发生整合的概率更高2。将大幅度减少,在此情况下,低度的E2蛋白将与启 而对于HPV基因,其结构不稳定的开放阅读框更易动子远端的2个E2BS结合,使E6、E7蛋白过表达 与宿主基因组发生整合,而这些开放阅读框中又以使感染细胞更易于倾向于永生化,癌变概率增加 E2基因铰链区结构最不稳定,因此位于3132~2.3E6和E7基因的保留与过表达 3384核苷酸位置的E2区是病毒与宿主基因组整合2.3.1E6基因机体细胞通常受到一些内源性因 发生频率最高的区域,也是整合过程中最常见的缺素(如细胞代谢、DNA复制及重组过程中出错)和 失或断裂部位,亦为整合过程中HPV基因破坏最严外源性因素(如紫外线及化学药物作用)的影响,使 重的区域(2。E2基因负性调节E6及E7基因的表细胞基因组受损,机体可通过复杂的网络通路识别 达,缺失或破坏E2基因,削减了E2基因对E6、E7DNA损伤激活细胞周期检查点并促进DNA修复 基因的抑制作用,进而影响细胞的复制及转录过程。或清除机体里的高度损伤细胞。而p53蛋白作 此外, HPV DNA与宿主细胞基因组整合后染色体为抑癌因子,参与了细胞内的多个信号转导过程,包 可发生一定变化,如染色体易位、缺失甚至重排,增括细胞增殖、DNA修复,必要时可终止细胞进程,诱 加了染色体结构的不稳定性,当抑癌基因结构不稳发细胞凋亡。因此,p53基因的沉默或突变可能 定后,细胞发生癌变的概率将大幅度上升2。除此会扰乱细胞内信号转导通路,使细胞生长、凋亡过程 以外,HPⅤDNA与宿主基因整合并不是致宫颈癌失控,从而诱发细胞癌变。当DNA受损程度轻 的唯一因素,HPV病毒基因高甲基化也会影响E2时,机体内p53蛋白表达水平增高,使受损细胞停留 基因的转录,虽然没有破坏E2基因的结构,但也间在G1检验点,进行DNA修复,从而维持细胞基因 接影响了E6、E7基因的表达。 组的完整性。当DNA修复失败后p53蛋白则会启 22缺失E2基因的表达 动细胞凋亡通路,诱发细胞老化或凋亡,从而减少基 E2基因在病毒生命周期中发挥了很大的作用,因组突变发生的概率。E6蛋白可以与多种宿主 E2基因具有1个DNA结合结构域和反式激活结构细胞蛋白相互作用,如p53,E6AP,MAML1,视网膜 域,它们通过富含丝氨酸-精氨酸的铰链区连接,E2母细胞瘤家族蛋白和含锌指结构蛋白,E6蛋白可使 基因编码的E2蛋白通常与LCR中的同源序列E2这些蛋白质失活从而影响多种细胞途径,如细胞增 结合位点(E2BS)结合形成同源二聚体,该二聚体中殖和凋亡。2016年1月, Nature杂志报道了法国斯 包含病毒早期启动子、复制起点、增强子、多腺苷酸特拉斯堡大学生物技术学院的 Martinez-Zapien教 化位点等。黏膜感染性HPV病毒具有4个授团队关于HPV介导的p53降解所需的E6/ E2BS,其中2个E2BS靠近病毒早期启动子,第3个E6AP/P53复合体的构建研究,他们在体外大肠杆 位于DNA复制起点,第4个位于增强子区域E2蛋菌BL21(DE3)细胞中分别表达了E6、E6AP及 白与E2BS结合后会刺激或抑制E6E7癌基因的表p53,在缓冲液B中以1:1:1的化学计量比混合,结 达,从而调控病毒的复制周期。已有证据表明,E2晶浓缩后纯化,获得初始E6/E6AP/p53复合体晶因的保留和过表达［１８］ ，Ｅ５ 蛋白作为癌蛋白也参与 了 ＨＰＶ 感染细胞癌变的过程［１３］ 。 ２．１ ＨＰＶ ＤＮＡ 在宿主细胞中的整合 近年来有研究表明，多数 ＨＰＶ 感染是一过性 的，一般在感染后 ６ ～ １２ 个月通过机体免疫系统作 用会转阴，但当机体免疫力下降或 ＤＮＡ 发生突变 后，部分亚型 ＨＰＶ ＤＮＡ 可随机与感染细胞基因组 发生整合，使细胞周期调节系统失控。 因此，从宿主 细胞感染 ＨＰＶ 发展至宫颈癌，ＨＰＶ ＤＮＡ 随机整合 到人类基因组中这一步骤必不可少［１９⁃２０］ 。 在人类 基因组中，ＨＰＶ ＤＮＡ 可以与人类基因组中的各个 ＤＮＡ 开放阅读框发生随机整合，但其中与结构不稳 定的染色体（如 ３ｑ２８、４ｑ１３􀆰 ３、８ｑ２４􀆰 ２１、１３ｑ２２􀆰 １ 和 １７ｑ２１ 或 ｍｉＲＮＡ 簇附近）发生整合的概率更高［２１］ 。 而对于 ＨＰＶ 基因，其结构不稳定的开放阅读框更易 与宿主基因组发生整合，而这些开放阅读框中又以 Ｅ２ 基因铰链区结构最不稳定，因此位于 ３ １３２ ～ ３ ３８４ 核苷酸位置的 Ｅ２ 区是病毒与宿主基因组整合 发生频率最高的区域，也是整合过程中最常见的缺 失或断裂部位，亦为整合过程中 ＨＰＶ 基因破坏最严 重的区域［２２］ 。 Ｅ２ 基因负性调节 Ｅ６ 及 Ｅ７ 基因的表 达，缺失或破坏 Ｅ２ 基因，削减了 Ｅ２ 基因对 Ｅ６、Ｅ７ 基因的抑制作用，进而影响细胞的复制及转录过程。 此外，ＨＰＶ ＤＮＡ 与宿主细胞基因组整合后染色体 可发生一定变化，如染色体易位、缺失甚至重排，增 加了染色体结构的不稳定性，当抑癌基因结构不稳 定后，细胞发生癌变的概率将大幅度上升［２３］ 。 除此 以外，ＨＰＶ ＤＮＡ 与宿主基因整合并不是致宫颈癌 的唯一因素，ＨＰＶ 病毒基因高甲基化也会影响 Ｅ２ 基因的转录，虽然没有破坏 Ｅ２ 基因的结构，但也间 接影响了 Ｅ６、Ｅ７ 基因的表达［２４］ 。 ２．２ 缺失 Ｅ２ 基因的表达 Ｅ２ 基因在病毒生命周期中发挥了很大的作用， Ｅ２ 基因具有 １ 个 ＤＮＡ 结合结构域和反式激活结构 域，它们通过富含丝氨酸 精氨酸的铰链区连接，Ｅ２ 基因编码的 Ｅ２ 蛋白通常与 ＬＣＲ 中的同源序列 Ｅ２ 结合位点（Ｅ２ＢＳ）结合形成同源二聚体，该二聚体中 包含病毒早期启动子、复制起点、增强子、多腺苷酸 化位 点 等［２５］ 。 黏 膜 感 染 性 ＨＰＶ 病 毒 具 有 ４ 个 Ｅ２ＢＳ，其中 ２ 个 Ｅ２ＢＳ 靠近病毒早期启动子，第 ３ 个 位于 ＤＮＡ 复制起点，第 ４ 个位于增强子区域，Ｅ２ 蛋 白与 Ｅ２ＢＳ 结合后会刺激或抑制 Ｅ６、Ｅ７ 癌基因的表 达，从而调控病毒的复制周期。 已有证据表明，Ｅ２ 在控制病毒早期启动子方面具有抑制功能。 当 Ｅ２ 蛋白浓度低时，Ｅ２ 将优先与启动子远端 ２ 个 Ｅ２ＢＳ 结合，导致早期病毒蛋白 Ｅ６、Ｅ７ 的产生增加。 随着 Ｅ２ 蛋白浓度的增加，相对于启动子远端的 ２ 个 Ｅ２ＢＳ，更多 Ｅ２ 蛋白将与启动子近端的 ２ 个 Ｅ２ＢＳ 结合，通过置换结合位点的特异性蛋白 １（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １， Ｓｐ１） 和 ＴＡＴＡ 结合蛋白（ＴＡＴＡ⁃ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＴＢＰ）使 Ｅ６、Ｅ７ 的转录受抑制［２６］ 。 另一方 面，Ｅ２ 可以与 ＨＰＶ 复制过程中的解旋酶相互作用 促进 ＤＮＡ 复制。 如 ２􀆰 １ 所提及，ＨＰＶ 的致癌过程 与 ＨＰＶ 病毒与宿主基因组整合密不可分，而与宿主 基因组整合后，Ｅ２ 基因铰链区是最常见的缺失或断 裂部位，因此整合后的宿主细胞内 Ｅ２ 蛋白的表达 将大幅度减少，在此情况下，低度的 Ｅ２ 蛋白将与启 动子远端的 ２ 个 Ｅ２ＢＳ 结合，使 Ｅ６、Ｅ７ 蛋白过表达， 使感染细胞更易于倾向于永生化，癌变概率增加。 ２．３ Ｅ６ 和 Ｅ７ 基因的保留与过表达 ２．３．１ Ｅ６ 基因 机体细胞通常受到一些内源性因 素（如细胞代谢、ＤＮＡ 复制及重组过程中出错） 和 外源性因素（如紫外线及化学药物作用）的影响，使 细胞基因组受损，机体可通过复杂的网络通路识别 ＤＮＡ 损伤、激活细胞周期检查点并促进 ＤＮＡ 修复 或清除机体里的高度损伤细胞［２７］ 。 而 ｐ５３ 蛋白作 为抑癌因子，参与了细胞内的多个信号转导过程，包 括细胞增殖、ＤＮＡ 修复，必要时可终止细胞进程，诱 发细胞凋亡［２８］ 。 因此，ｐ５３ 基因的沉默或突变可能 会扰乱细胞内信号转导通路，使细胞生长、凋亡过程 失控，从而诱发细胞癌变［２９］ 。 当 ＤＮＡ 受损程度轻 时，机体内 ｐ５３ 蛋白表达水平增高，使受损细胞停留 在 Ｇ１ 检验点，进行 ＤＮＡ 修复，从而维持细胞基因 组的完整性。 当 ＤＮＡ 修复失败后 ｐ５３ 蛋白则会启 动细胞凋亡通路，诱发细胞老化或凋亡，从而减少基 因组突变发生的概率［３０］ 。 Ｅ６ 蛋白可以与多种宿主 细胞蛋白相互作用，如 ｐ５３，Ｅ６ＡＰ，ＭＡＭＬ１，视网膜 母细胞瘤家族蛋白和含锌指结构蛋白，Ｅ６ 蛋白可使 这些蛋白质失活从而影响多种细胞途径，如细胞增 殖和凋亡。 ２０１６ 年 １ 月，Ｎａｔｕｒｅ 杂志报道了法国斯 特拉斯堡大学生物技术学院的 Ｍａｒｔｉｎｅｚ⁃Ｚａｐｉｅｎ 教 授团 队 关 于 ＨＰＶ 介 导 的 ｐ５３ 降 解 所 需 的 Ｅ６ ／ Ｅ６ＡＰ ／ Ｐ５３ 复合体的构建研究，他们在体外大肠杆 菌 ＢＬ２１ （ ＤＥ３） 细胞中分别表达了 Ｅ６、 Ｅ６ＡＰ 及 ｐ５３，在缓冲液 Ｂ 中以 １ ∶１ ∶１ 的化学计量比混合，结 晶浓缩后纯化，获得初始 Ｅ６ ／ Ｅ６ＡＰ ／ ｐ５３ 复合体晶 ·３９０· 同济大学学报（医学版） 第 ４１ 卷