的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定。在高pH时,RNA的磷酸酯键易被水解,而DNA 的磷酸酯键不易被水解。 水解核酸的酶有很多种,若按底物专一性分类,作用于RNA的称为核糖核酸酶 ( ribonuclease, RNase),作用于DNA的则称为脱氧核糖核酸酶( deoxyribonuclease, DNase) 按对底物作用方式分类可分核酸内切酶( endonuclease)与核酸外切酶( exonuclease)。核酸 内切酶的作用是在多核苷酸内部的3’,5'磷酸二酯键,有些内切酶能识别DNA双链上特异 序列并水解有关的3’,5磷酸二酯键。核酸内切酶是非常重要的工具酶,在基因工程中有广 泛用途。而核酸外切酶只对核酸末端的3’,5'磷酸二酯键有作用,将核苷酸一个一个切下, 可分为5→3外切酶,与3’→5°外切酶 三、核酸的变性、复性和杂交 (一)变性 在一定理化因素作用下,核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂,变成单链的现 象称为变性( denaturation)。引起核酸变性的常见理化因素有加热、酸、碱、尿素和甲酰胺 等。在变性过程中,核酸的空间构象被破坏,理化性质发生改变。由于双螺旋分子内部的碱 基暴露,其A260值会大大增加。A260值的增加与解链程度有一定比例关系,这种关系称 为增色效应( hyperchromic effect)(图3-24)。如果缓慢加热DNA溶液,并在不同温度测定 其A260值,可得到“S”形DNA熔化曲线( melting curve)(图3-25a)。从DNA熔化曲 线可见DNA变性作用是在一个相当窄的温度内完成的 当A260值开始上升前DNA是双螺旋结构,在上升区域分子中的部分碱基对开始断裂, 其数值随温度的升高而增加,在上部平坦的初始部分尚有少量碱基对使两条链还结合在 起,这种状态一直维持到临界温度,此时DNA分子最后一个碱基对断开,两条互补链彻底 分离。通常把加热变性时DNA溶液A260升高达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔 解温度( melting temperature Tm),Tm是研究核酸变性很有用的参数。Tm一般在85~95℃ 之间,Tm值与DNA分子中GC含量成正比 (二)复性 变性DNA在适当条件下,可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为复性 ( renaturation)。当热变性的DNA经缓慢冷却后复性称为退火( annealing)(图3-26)。DNA 复性是非常复杂的过程,影响DNA复性速度的因素很多:DNA浓度高,复性快;DNA分 子大复性慢;高温会使DNA变性,而温度过低可使误配对不能分离等等。最佳的复性温度的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定。在高 pH 时，RNA 的磷酸酯键易被水解，而 DNA 的磷酸酯键不易被水解。 水解核酸的酶有很多种，若按底物专一性分类，作用于 RNA 的称为核糖核酸酶 （ribonuclease，RNase），作用于 DNA 的则称为脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）。 按对底物作用方式分类,可分核酸内切酶（endonuclease）与核酸外切酶（exonuclease）。核酸 内切酶的作用是在多核苷酸内部的 3’，5’磷酸二酯键，有些内切酶能识别 DNA 双链上特异 序列并水解有关的 3’，5’磷酸二酯键。核酸内切酶是非常重要的工具酶，在基因工程中有广 泛用途。而核酸外切酶只对核酸末端的 3’，5’磷酸二酯键有作用，将核苷酸一个一个切下， 可分为 5’→3’外切酶，与 3’→5’外切酶。 三、核酸的变性、复性和杂交 （一） 变性 在一定理化因素作用下，核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂，变成单链的现 象称为变性（denaturation）。引起核酸变性的常见理化因素有加热、酸、碱、尿素和甲酰胺 等。在变性过程中，核酸的空间构象被破坏，理化性质发生改变。由于双螺旋分子内部的碱 基暴露，其 A260 值会大大增加。A260 值的增加与解链程度有一定比例关系，这种关系称 为增色效应（hyperchromic effect）(图 3-24)。如果缓慢加热 DNA 溶液，并在不同温度测定 其 A260 值，可得到 “S”形 DNA 熔化曲线（melting curve）（图 3-25a）。从 DNA 熔化曲 线可见 DNA 变性作用是在一个相当窄的温度内完成的。 当 A260 值开始上升前 DNA 是双螺旋结构，在上升区域分子中的部分碱基对开始断裂， 其数值随温度的升高而增加，在上部平坦的初始部分尚有少量碱基对使两条链还结合在一 起，这种状态一直维持到临界温度，此时 DNA 分子最后一个碱基对断开，两条互补链彻底 分离。通常把加热变性时 DNA 溶液 A260 升高达到最大值一半时的温度称为该 DNA 的熔 解温度（melting temperature Tm），Tm 是研究核酸变性很有用的参数。Tm 一般在 85～95℃ 之间，Tm 值与 DNA 分子中 G C 含量成正比。 （二） 复性 变性 DNA 在适当条件下，可使两条分开的单链重新形成双螺旋 DNA 的过程称为复性 （renaturation）。当热变性的 DNA 经缓慢冷却后复性称为退火（annealing）（图 3-26）。DNA 复性是非常复杂的过程，影响 DNA 复性速度的因素很多：DNA 浓度高，复性快；DNA 分 子大复性慢；高温会使 DNA 变性，而温度过低可使误配对不能分离等等。最佳的复性温度