第4期李杰等植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 规方法是酶解法.用酶解法游离原生质体时,首先要考虑植物材料的正确选择.一般情况 下,当植物处于最佳生长状态时取材,分离的效果最为理想.如茄科植物一般选取生长旺 盛、生理状态一致的试管苗上部叶片121,而禾本科植物大多数选取胚性悬浮细胞系为材 料3.一个处于指数期快速生长的细胞培养体系,如愈伤组织或悬浮培养物,最适宜作为游 离原生质体的材料.其次,要选择合适的水解酶种类、组合及浓度.目前市场上出现了许多 游离原生质体的酶制品,但各种酶的性质活性、纯度及作用有很大的差别,选用时应根据植 物材料和酶制品的特性进行综合考虑.此外,还必须控制好酶解条件.影响酶解过程的主要 因素有温度φH值、渗透压、离子浓度、振荡及预处理等.一般情况下,酶解温度为25 30℃酶解液的pH值根据所用酶种类的不同可以在5.4~62之间变动,渗压剂的使用浓 度,一般控制在0.45~0.8mm/L范围内.酶解前对材料进行轻微的质壁分离,酶解时低速 振荡(40r/min)以及酶解液中高钙镁离子浓度(CaCl2和MCl2)等能提高原生质体的产量和 质量.原生质体成功游离后的提纯方法常用的有漂浮法和沉降界面法.漂浮法在洗涤纯化 过程中对原生质体的损伤较小,但对离心力要求严格,不易掌握,沉降界面法易造成原生质 体损伤,但操作简单.具体选择方法则依实验条件而定 1.2原生质体的培养 在培养方式上,植物原生质烋培养常采用固体包埋培养、液体培养、固液双层培养以及 在此基础上发展起来的一些其它培养方式.固体包埋培养能提高培养初期原生质体的成活 率,利于定点观察,但不利于通气和培养后期代谢物的排出.相比而言,多数实验者喜欢采 用液体浅层培养法.这种方法的优点是培养物与空气接触面大,易于通气,添加更换培养基 和转移操作方便,细胞悬浮培养中产生的有害代谢产物易于扩散,但不利于定点观察,易造 成原生质体局部密度过高或过低.在固液双层培养法中, Shillito等建立的念珠培养法是比 较好的一种方法,它是将含有原生质体的琼脂糖培养基切成小块放在液体培养基中进行振 荡培养.用这种方法,明显提高了矮牵牛( Petunia hvbnidia)、番茄( Lycopersicum esculentum)、芜 菁( Brassica ra)等原生质体培养的植板率.在上述培养方式中,均可以加入未去壁但失 去分化能力的完整细胞进行原生质体的看护培养( nurse culture),能明显提高培养效果.Mt gu等用这样的方法,极大提高了百合(LimL.)原生质体培养初期的成活率 在培养基的选择上,两种最常用的培养基为8P和NT,它们分别是由B5和MS培养基改 良而形成的.在这些基本培养基的基础上,针对不同植物材料和不同的培养阶段可以进行 适当修改大量元素中Mg2+c2+浓度变化最多,铵态氮和硝态氮的比例及用量,不同实验 也不尽相同.对碳源的要求一般不专一,多数采用蔗糖,或者以蔗糖和葡萄糖混合使用作为 碳源营养.在激素使用上,般须在含有一种生长素和一种细胞分裂素的培养基中才能正 常分裂和生长.最常用的外源生长素是2,4D,但对细胞分裂素的需求,各种文献报道不 致。原生质体对外源激素的需求可能会随培养时间的推移而发生改变.如烟草( nicotiana abacus)原生质体在培养基中生长素水平降低或其作用消除后,会迅速生长并随之发生植株 再生6.此外,还发现一些其它化合物对原生质体的生长和分裂有一定影响.如鸟氨酸和丁 二胺对木本植物的叶组织原生质体分裂和细胞团形成有利,亚精胺-精胺类多胺物质则对 禾谷类植物的原生质体分裂有促进作用.在培养密度和条件上,根据物种和材料来源的 201994-2008ChinaaCademicournalElectronicPublishingHouse.dllrightsreservedhttp://www.cnki.ner规方法是酶解法. 用酶解法游离原生质体时 ,首先要考虑植物材料的正确选择. 一般情况 下 ,当植物处于最佳生长状态时取材 ,分离的效果最为理想. 如茄科植物一般选取生长旺 盛、生理状态一致的试管苗上部叶片[2 ] ,而禾本科植物大多数选取胚性悬浮细胞系为材 料[3 ] . 一个处于指数期快速生长的细胞培养体系 ,如愈伤组织或悬浮培养物 ,最适宜作为游 离原生质体的材料. 其次 ,要选择合适的水解酶种类、组合及浓度. 目前市场上出现了许多 游离原生质体的酶制品 ,但各种酶的性质、活性、纯度及作用有很大的差别 ,选用时应根据植 物材料和酶制品的特性进行综合考虑. 此外 ,还必须控制好酶解条件. 影响酶解过程的主要 因素有温度、pH 值、渗透压、离子浓度、振荡及预处理等. 一般情况下 ,酶解温度为 25～ 30 ℃,酶解液的 pH 值根据所用酶种类的不同可以在 514～612 之间变动 ,渗压剂的使用浓 度 ,一般控制在 0145～018 mmol/ L 范围内. 酶解前对材料进行轻微的质壁分离 ,酶解时低速 振荡(40 r/ min) 以及酶解液中高钙镁离子浓度(CaCl2 和 MgCl2 ) 等能提高原生质体的产量和 质量. 原生质体成功游离后的提纯方法常用的有漂浮法和沉降界面法. 漂浮法在洗涤纯化 过程中对原生质体的损伤较小 ,但对离心力要求严格 ,不易掌握 ,沉降界面法易造成原生质 体损伤 ,但操作简单. 具体选择方法则依实验条件而定. 112 原生质体的培养 在培养方式上 ,植物原生质体培养常采用固体包埋培养、液体培养、固液双层培养以及 在此基础上发展起来的一些其它培养方式. 固体包埋培养能提高培养初期原生质体的成活 率 ,利于定点观察 ,但不利于通气和培养后期代谢物的排出. 相比而言 ,多数实验者喜欢采 用液体浅层培养法. 这种方法的优点是培养物与空气接触面大 ,易于通气 ,添加更换培养基 和转移操作方便 ,细胞悬浮培养中产生的有害代谢产物易于扩散 ,但不利于定点观察 ,易造 成原生质体局部密度过高或过低. 在固液双层培养法中 ,Shillito 等[4 ]建立的念珠培养法是比 较好的一种方法 , 它是将含有原生质体的琼脂糖培养基切成小块放在液体培养基中进行振 荡培养. 用这种方法 ,明显提高了矮牵牛( Petunia hybridia) 、番茄( Lycopersicum esculentum) 、芜 菁( Brassica rapa) 等原生质体培养的植板率[4 ] . 在上述培养方式中 ,均可以加入未去壁但失 去分化能力的完整细胞进行原生质体的看护培养(nurse culture) ,能明显提高培养效果. Mit2 sugu 等[5 ]用这样的方法 ,极大提高了百合(Lilium L. ) 原生质体培养初期的成活率. 在培养基的选择上 ,两种最常用的培养基为 8P 和 NT ,它们分别是由 B5 和 MS 培养基改 良而形成的. 在这些基本培养基的基础上 ,针对不同植物材料和不同的培养阶段可以进行 适当修改. 大量元素中 Mg2 + 、Ca2 +浓度变化最多 ,铵态氮和硝态氮的比例及用量 ,不同实验 也不尽相同. 对碳源的要求一般不专一 ,多数采用蔗糖 ,或者以蔗糖和葡萄糖混合使用作为 碳源营养. 在激素使用上 ,一般须在含有一种生长素和一种细胞分裂素的培养基中才能正 常分裂和生长. 最常用的外源生长素是 2 ,42D ,但对细胞分裂素的需求 ,各种文献报道不一 致. 原生质体对外源激素的需求可能会随培养时间的推移而发生改变. 如烟草 (Nicotiana tabacum) 原生质体在培养基中生长素水平降低或其作用消除后 ,会迅速生长并随之发生植株 再生[6 ] . 此外 ,还发现一些其它化合物对原生质体的生长和分裂有一定影响. 如鸟氨酸和丁 二胺对木本植物的叶组织原生质体分裂和细胞团形成有利 ,亚精胺 - 精胺类多胺物质则对 禾谷类植物的原生质体分裂有促进作用[6 ] . 在培养密度和条件上 ,根据物种和材料来源的 第 4 期 李 杰 ,等 :植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 56 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net