催化反应的活化能,测定米氏常数Km、最大反应速度Vmax和各种抑制剂常数K1,由 此掌握酶动力学性质分析的一般实验方法 本实验是以蔗糖为底物,测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线,即在酶反应的最 适条件下,每间隔一定的时间测定产物的生成量,然后以酶反应时间为横座标,产物生 成量为纵座标,画出酶反应的时间进程曲线,由该曲线可以看出,曲线的起始部分在某 段时间范围内呈直线,其斜率代表酶反应的初速度。随着反应时间的延长,曲线斜率 不断减小,说明反应速度逐渐降低,这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆 反应加强等原因所致,因此测定准确的酶活力,必须在进程曲线的初速度时间范围内进 行,测定这一曲线和初速度的时间范围,是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。 实验方法见“表2”: 1.准备12支试管,按“表2”进行测定。用反应时间为0的第一管作空白对照,此 试管要先加碱性铜试剂后加酶。第10支试管是校正蔗糖的酸水解。用第11管作为对照, 测定第12管葡萄糖标准的光吸收值,用以计算第2~9各测定管所生成还原糖的 “μ umoles”数 2.“表2”中底物蔗糖的量为每管0.25μ moles,全部反应后可产生0.5 umoles的还原 糖,所有的蔗糖和酶浓度应使底物在20min内基本反应完。 3.画出生成的还原糖的μmoes数(即产物浓度 umoles/m)与反应时间的关系曲线, 即反应的时间进程曲线,求出反应的初速度。 表2反应时间对产物浓度的影响 匚管数→ 123456789101112 25mm0L蔗糖|01010101010101010101 乙酸缓冲液 0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/ H,O 0404040404040404040.71.008 葡萄糖2 mmol/L|/7 //0. 减性铜试剂 由加酶开始计时 蔗糖酶(-1:5)0.30.30.30.30.30.30.30.30.377 应时间min0134812203040 反应到时后立即向“2~12”管加入lml碱性铜试剂中止反应 碱性铜试剂 /1010101010101010101010 盖薄膜,扎孔,沸水浴上煮8min后速冷 磷钼酸试剂1.01.01.010101.0101.0101.01.010 HO 505050505050505050505050 测定A650 生成还原糖的 oles数231 催化反应的活化能，测定米氏常数 Km、最大反应速度 Vmax 和各种抑制剂常数 KI ，由 此掌握酶动力学性质分析的一般实验方法。 本实验是以蔗糖为底物，测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线，即在酶反应的最 适条件下，每间隔一定的时间测定产物的生成量，然后以酶反应时间为横座标，产物生 成量为纵座标，画出酶反应的时间进程曲线，由该曲线可以看出，曲线的起始部分在某 一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。随着反应时间的延长，曲线斜率 不断减小，说明反应速度逐渐降低，这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆 反应加强等原因所致，因此测定准确的酶活力，必须在进程曲线的初速度时间范围内进 行，测定这一曲线和初速度的时间范围，是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。 实验方法见“表 2”： 1. 准备 12 支试管，按“表 2”进行测定。用反应时间为 0 的第一管作空白对照，此 试管要先加碱性铜试剂后加酶。第 10 支试管是校正蔗糖的酸水解。用第 11 管作为对照， 测定第 12 管葡萄糖标准的光吸收值，用以计算第 2～9 各测定管所生成还原糖的 “moles”数。 2. “表 2”中底物蔗糖的量为每管 0.25 moles，全部反应后可产生 0.5moles 的还原 糖，所有的蔗糖和酶浓度应使底物在 20min 内基本反应完。 3. 画出生成的还原糖的moles 数（即产物浓度moles/ml）与反应时间的关系曲线， 即反应的时间进程曲线，求出反应的初速度。 表 2 反应时间对产物浓度的影响 管数→ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2.5mmol/L 蔗糖 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 / / 乙酸缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / H2O 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.7 1.0 0.8 葡萄糖 2mmol/L / / / / / / / / / / / 0.2 碱性铜试剂 1.0 / / / / / / / / / / / 由加酶开始计时 蔗糖酶(~1:5) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 / / / 反应时间 min 0 1 3 4 8 12 20 30 40 反应到时后立即向“2～12”管加入 1ml 碱性铜试剂中止反应 碱性铜试剂 / 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 盖薄膜，扎孔，沸水浴上煮 8min 后速冷 磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 测定 A650 生成还原糖的 moles 数