1006 中国水产科学 第14卷 的峰面积,每个时间点设5个平行样,按1.4中所述式为 方法制样,进行HPC检测,根据标准曲线计算EF ⊥_Km Clint= 和CF浓度。 Lowry法l测定细胞中蛋白含量,则 EF脱乙基酶的活性以酶促反应速率,即每mg蛋白 其中Km为米氏常数,Vmx为最大反应速率 单位时间内的CF生成量[g/( min mg)]表示。 m为内在清除率 1.7数据处理 2结果与分析 数据处理中利用SPSS(11.5)进行显著性分析 采用 one- way anovA(单因素方差分析)中的Dum2.1色谱条件的确定 can检验进行多重比较,当P<0.05时认为差异显 优化流动相组成、pH和流速等条件后,EF和 著。消除方程采用C=Coe-k公式经非线性过程CF药物峰峰形较好且能完全分离,并且与杂质峰完 处理,C表示药物浓度,C0表示初始浓度,k表示消全分开。CF保留时间在4.91mn左右,EF保留时 除速率常数。药酶反应动态图采用 Excel软件绘间在6.73min左右,空白样品提取液在上述保留时 制;参照林茂等121所采用的 LineweaverBurk方程间无干扰峰出现(图2)。 式作图反映药酶动力学,并计算酶动力学参数,其公 Norm 120 保留时间/ min Retention time 保留时间/ min Retention time 保留时间/ min Retention time 图2恩诺沙星(EF)及环丙沙星(CP在大口黑鲈肝细胞中的色谱图 A:空白细胞提取液B:含EF10gm的细胞提取液;C:EF与细胞孵育45min Fig 2 HPLC chromatogram for EF and CF in Micropterus salmoides hepatocytes A: HPLC chromatogram from cells free of EF and CF; B: HPLC chromatogram of EF (1OWg/ mL) extracted from cell C: HPLC chromatogram of EF incubated with cell for 45 minutes 2.2定量方法 的LOD为0.05ugmL,CF在细胞中的LOD为 2.2.1标准曲线及线性范围标准曲线的药物浓0.02ug/mL。 度线性范围、回归方程及相关系数如下(A1表示药2.2.3回收率和变异系数按1.4制样方法操作 物与内标峰面积比,C1表示药物标准品在空白细胞后,由表1可见。测得各样品中平均回收率均大于 中的浓度):EF0.02~200ug/mL,A1=140.13C-(80.28±4.44)%,测得的日内变异系数不大于 5748,R=0.9999;CF0.02~200ug/m,A1=5.13%,日间变异系数不大于5.54%。所得数据表 9578C-93.15,R=0.9998 明此方法的重现性好,精密度高。 222最低检测限(LOD)经测得EF在细胞中 表1空白细胞中添加EF和CF时回收率及变异系数 Tab. I Recoveries and CV of EF and CF to Micropterus salmoides Hepatocytes n=5:X+SD; CE 质量浓度 回收率 异系数 变异系数CV (ug mL) 日内 日间 回收率 日内 日间 Reoovery rate Recovery rate 82.70±.44 80.28±4.4 5.13 83.19±4.37 85.88±4 91.54+424 4.63 90,73+3.60 3.97 o1994-2009ChinaAcademicjOUrmalElectronicPublishinghOuse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net的峰面积 ,每个时间点设 5 个平行样 ,按 114 中所述 方法制样 ,进行 HPLC 检测 ,根据标准曲线计算 EF 和 CF 浓度。Lowry 法[11 ]测定细胞中蛋白含量 ,则 EF 脱乙基酶的活性以酶促反应速率 ,即每 mg 蛋白 单位时间内的 CF 生成量[μg/ (min·mg) ]表示。 117 数据处理 数据处理中利用 SPSS(1115) 进行显著性分析 , 采用 one2way ANOVA (单因素方差分析) 中的 Dun2 can 检验进行多重比较 ,当 P < 0105 时认为差异显 著。消除方程采用 Ci = C0 e - k t公式经非线性过程 处理 , Ci表示药物浓度 , C0表示初始浓度 ,k 表示消 除速率常数。药酶反应动态图采用 Excel 软件绘 制 ;参照林茂等[12 ]所采用的 Lineweaver2Burk 方程 式作图反映药酶动力学 ,并计算酶动力学参数 ,其公 式为 : 1 V = Km V max × 1 [ S ] + 1 V max , Clint = V max Km 其中 Km 为米氏常数 , V max为最大反应速率 , Clint为内在清除率。 2 结果与分析 211 色谱条件的确定 优化流动相组成、p H 和流速等条件后 , EF 和 CF 药物峰峰形较好且能完全分离 ,并且与杂质峰完 全分开。CF 保留时间在 4191 min 左右 ,EF 保留时 间在 6173 min 左右 ,空白样品提取液在上述保留时 间无干扰峰出现(图 2) 。 图 2 恩诺沙星( EF) 及环丙沙星(CF) 在大口黑鲈肝细胞中的色谱图 A :空白细胞提取液 ;B :含 EF 10μg/ mL 的细胞提取液 ;C: EF 与细胞孵育 45 min Fig12 HPLC chromatogram for EF and CF in Micropterus salmoides hepatocytes A :HPLC chromatogram from cells free of EF and CF ;B :HPLC chromatogram of EF (10μg/ mL) extracted from cell ;C: HPLC chromatogram of EF incubated with cell for 45 minutes. 212 定量方法 21211 标准曲线及线性范围 标准曲线的药物浓 度线性范围、回归方程及相关系数如下 ( A i 表示药 物与内标峰面积比 , Ci 表示药物标准品在空白细胞 中的浓度) :EF 0102～200μg/ mL , A i = 140113 Ci - 57148 , R = 01999 9 ; CF 0102～200 μg/ mL , A i = 95178 Ci - 93115 , R = 01999 8。 21212 最低检测限( LOD) 经测得 EF 在细胞中 的 LOD 为 0105μg/ mL , CF 在细胞中的 LOD 为 0102μg/ mL 。 21213 回收率和变异系数 按 114 制样方法操作 后 ,由表 1 可见。测得各样品中平均回收率均大于 (80128 ±4144) % , 测得的日内变异系数不大于 5113 % ,日间变异系数不大于 5154 %。所得数据表 明此方法的重现性好 ,精密度高。 表 1 空白细胞中添加 EF和 CF时回收率及变异系数 Tab11 Recoveries and CV of EF and CF to Micropterus salmoides Hepatocytes n = 5 ; X ±SD ; % 质量浓度 (μg·mL - 1 ) EF CF 回收率 Recovery rate 变异系数 CV 日内 Intra2day 日间 Inter2day 回收率 Recovery rate 变异系数 CV 日内 Intra2day 日间 Inter2day 0102 82170 ±4144 4107 5137 80128 ±4144 5113 5154 20 83119 ±4137 3144 5125 85188 ±4166 4134 5143 200 91154 ±4124 3111 4163 90173 ±3160 3127 3197 1006 中 国 水 产 科 学 第 14 卷