第3期 王方华等:草鱼病毒性出血病研究进展 67 主型和肠炎型。 蛋的形式存在,不含脂类9N温度(6 鱼出血病的发病季节长,每年6月下淘至9月胺是有一定的稳定性,但反复抹配会对病毒感染力有较大影闻 主要流行季节,高峰在8月,1求温5.30最为流行,航对2氯仿、乙等有机溶刘有一定的抗性,酸(: 死亡率高,高密黄同养的值种池危害更甚,含发生养的y39(:1)0不最这,完整病幸在氧化中的浮 草鱼全军瘦没。人工感染健莱草鱼,从感染到发病死约力密度约13yd。在蔗糖中浮度135 454-070,其病程有潜第期、前趋期和发另外,用蛋白酶或類酸处理(CRX,病滴度降有 展期3个阶段 巽在期年,腿样擎注到联有13组隐鸡养和特性 鱼病鱼,(4年开始怀疑它可能是种航忙疾病。0mt(并增猫和传代产生合体状 喜等用分病的方法从鱼组得到A说感染草,越数已建起多32该的1 获得型出血状并在单层细中传代繁柱,才迁式系。病复在,能形成温格排列在体 定草鱼出春是由病喜起其根播病的形态和理化细培中最2-感2即开 特性,将其定名为草鱼场(1:p2,14.2h大量增瓶,使细产生典型的病浮变化 0N,)病喜求属水生呼备8属(4h0,减直2m5d达到最 是中国分离的第种鱼类病0能染草鱼外￥,病的最鸡0后逐平缓于病邮 还能感染青麦楼鱼、布氏餐条和等,并能使这几单到机理、式范围及病的检测有商系的 鱼发生出血病症状而死亡,尤其是有死亡率高达 00该联的计观13不同地区分离的比较研究 主朋,能、鼻内支双有3前我道了多对该的分高各含 在另,王树坚等首报道了出血病鱼组织电 株的特行了册究道,时于各之间 硏究中发现了2种病毒願粒,一种是呼肠减病毒,另-种 的差异比较尚见有系统的报道。而就相关的分离抹进 是23m大的精精到是请传进的 RM病,后为单0N0这2系分,)进-建支病请的系化树提参 分别感草可孩不同的发麻吗肠喜比分离线性的0出同分萬妹 主要导致“出血型症状,另-种病毒(经初步鉴定属 杭原蛋白或基之间的主别,可为下一步亚单位疫苗和基 于小科援要导出生,的新楼生体,从而出保车美商的 转果时也爆不同状编职天能对有鸡〔保点 于隼小N解我单东的惠及用8种有魔保有分的 病的关系,未见有进-步的报道 对不同地区分离株的比较有较大的实历意义,应加大对这 2呼肠孤病毒的生物学特性研究进晨 方面研究力,补在该病李研所究中的空 2l病毒综构研究 31不同毒株力间核酸分子量的比较 近来,随最电使技术和计算三重鸡方法的2喜慧计子见表,从表中可以看出 丞步用,对于病毒的三维结构更糖的午正爱步0N间其基组油N段组成不 聂开,联近方等该分的集重同的,请总分子美不大,酯各片 与材克蛋台件果:N多层计量有排单间它们的基围图AE图 包图核中层号外克层20个楼1普中包可反来于这不同刚 B对称列的体构成外克美是在5次比的哥充可描这水生呼图孩病不成多 轴上出现三聚体R区,中体单位,的个标准另-步探时些不同基因片段解的 内克品1单成#特场美第,可以为进弄清组成该航请编构杯不 等成付内衣克8.过优0F完蛋我的美￥ 整献进电分,51日31不同病细鸡特性项性的较 组分(Wm分于量在3438:2间 现建立起多株对0N2感的编速(系,0不 22GN的理化特性呀究 同分离株对胞的感染性方面存在一定的差别葬 N接针质线总成,还含有少坐类,3等18219第 3期 王方华等:草鱼病毒性出血病研究进展 盖型和肠炎型。 、 ‘草鱼出血病的发病季节长，每年 6月下旬至9月底是 主要流行季节，高峰在 8月，在水温 25一30℃最为流行， 死亡率高，高密度饲养的鱼种池危害更甚，常发生养殖的 草鱼全军覆没。人工感染健康草鱼，从感染到发病死亡约 需4一15 d，一般7一10 d，其病程有潜伏期、前趋期和发 展期 3个阶段。 早在1953年，倪达书等「’]就注意到具有出血症状的草 鱼病鱼。1954年秋开始怀疑它可能是一种病毒性疾病。陈 燕0等用分离病毒的方法从病鱼组织得到的滤液感染草鱼， 获得典型的出血症状并能在单层细胞中传代繁殖，才正式 确定草鱼出血病是由病毒引起。其根据病毒的形态和理化 特性，将其定名为草鱼呼肠孤病毒 (Reovirus of,grass carp GCRV)，该病毒隶属水生呼肠孤病毒属 (助uareoviridae) , 是中国分离的第一种鱼类病毒〔’〕。GCRV除能感染草鱼外， 还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏餐条和鳃等，并能使这几种 鱼发生出血病症状而死亡，尤其是稀有峋螂死亡率高达 100%。电镜观察患病鱼的组织切片发现，在其肝脏、心 脏、肌肉、肾脏、脾、鳃和肠道内都发现有病毒粒子的存 在。另外，毛树坚等川曾报道了从出血病病鱼组织的电镜 研究中发现了2种病毒颗粒，一种是呼肠孤病毒，另一种 是20 -30 nm大小的病毒。经病毒的核酸分析，前者是双 股RNA病毒，后者为单股 RNA病毒，并且用这2种病毒 分别感染健康草鱼，可导致不同的发病症状:呼肠孤病毒 主要导致 “肠出血型症状” ，另一种病毒 (经初步鉴定属 于小RNA病毒科)主要导致 “肌肉出血型”出血病。此 结果同时也初步解释了出现不同症状出血病的原因。但关 于草鱼小RNA病毒导致草鱼出血病的病理机制以及病原和 病症的关系，未见有进一步的报道。 2 呼肠孤病毒的生物学特性研究进展 2.1 病毒结构研究 近年来，随着低温电镜技术和计算机三维重构方法的 逐步应用，对于病毒的三维结构更精细的研究工作正逐步 展开，最近方勤等〔4]对该病毒分辨率达到17埃的三维重构 与衣壳蛋白特性研究。结果表明:GCRV颗粒呈多层排列， 包括RNA核心与内壳层、中间层与外壳层。由200个按T =13对称排列的三聚体构成外衣壳。其典型特征是在 5次 轴上出现三聚体缺失凹陷区，暴露出中间层三聚体亚单位， 内壳层由120个单体构成，按T二1排列。结构特点与呼肠 孤病毒科成员内衣壳特征相一致。通过对纯化的GCRV完 整颗粒进行电泳分析，揭示成熟的病毒含有7种衣壳蛋白 组分 (VP1一VP7 )。分子量在34一138 kDa之间。 2.2 GCRV的理化特性研究 GCRV主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量的糖类， 以糖蛋白的形式存在，不含脂类[’〕。GCRV对温度 (5690 ) 有一定的稳定性，但反复冻融会对病毒感染力有较大影响， 病毒对氯仿、乙醚等有机溶剂有一定的抗性，对酸 (pH二 3)、碱 (pH二10)处理不敏感，完整病毒在氯化艳中的浮 力密度约1. 36 g " mL-' 。在蔗糖中浮力密度为1.305 g-m-3, 另外，用胰蛋白酶或精氨酸处理 GCRV，病毒滴度都略有 上升:‘丁。 2.3 细胞培养和感染特性 GCRV能感染培养细胞并增殖和传代，产生合胞体状 细胞病变效应 (CPE)。现已建立起多株对GCRV敏感的细 胞系川。病毒复制部位在胞浆，能形成晶格状排列，在体 外细胞培养中最佳增殖温度为2890，一般感染12 h后即开 始增殖，24一72 h大量增殖，使细胞产生典型的病理变化 (CPE)，形成直径约为2 mm的空斑}&'. 5 d左右达到最大 增殖，此时病毒的滴度最高，以后逐渐平缓。关于病毒的 致病机理、宿主范围及病毒的检测曾有系统的综述!9一川。 3 不同地区分离株的比较研究 目前已经报道了许多对于该病的分离株，并对各分离 株的特性分别进行了研究报道〔12一”」，但对于各分离株之间 的差异比较尚未见有系统的报道。而就相关的分离株进行 比较研究，有助于认识该病毒的遗传差异与进化、病毒的 区系分布等，为进一步构建该病毒的系统进化树提供参考。 同时通过比较各分离株免疫原性的差异，找出不同分离株 抗原蛋白或基因之间的差别，可为下一步亚单位疫苗和基 因疫苗的制作提供一些依据，从而能制备出保护率更高的 并能对所有GCRV病毒分离株进行免疫保护的疫苗，解决 目前一种疫苗不能保护鱼抵抗所有分离毒株的难题。因此 对不同地区分离株的比较有较大的实际意义，应加大对这 方面的研究力度，弥补在该病毒研究中的空缺。 3.1 不同毒株之间核酸分子A的比较 各毒株之间核酸分子量比较见表 1。从表中可以看出， GCRV不同分离株其基因组都由11个dsRNA片段组成，不 同的毒株之间，病毒基因组的总分子量差异不大，而各片 段分子量有所差异〔14,17]。这一点从它们的基因组PAGE图 谱中也可反映出来[’“〕。而对于这些不同毒株间基因组序列 比对的研究可作为描述水生呼肠孤病毒属不同成员多样性 的一个标准。另外进一步探讨这些不同基因片段所编码的 蛋白之间的差异，可以为进一步弄清组成该病毒结构的不 同蛋白及其所执行的功能差异奠定基础。 3.2 不同病毒株细胞感染特性和致病性的比较 现已建立起多株对GCRV敏感的细胞株 (系)， 但不 同分离株对细胞株的感染性方面存在一定的差别。李军 等〔”〕比较了GCRV861和GCRV873 2毒株的组织培养特性