1期 赵璐等:复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 213 242细菌BM-01和BM03的生理生化鉴定结果2.43分子生物学鉴定结果 细菌菌株BM-01、BM-03能发酵葡萄糖、麦芽 从菌株MMTL-1基因组DNA中扩增出约500bp 糖,硝酸盐还原反应生成红色化合物,可水解淀粉,的IS片段,经过序列对比与哈茨木霉 Trichoderma 明胶液化呈阳性,L-阿拉伯糖、甘露醇呈阳性,脂酶ha=iam、黄绿木霉T. aureoviride、非洲哈茨木霉 测定、甲基红试验、吲哚反应呈阴性,v-P测定能生T. froharzianum等菌株IS序列的相似度都在 成红色化合物。菌株BM-01不能利用乳糖,在加入9900%以上,选取10株相似度较高的木霉菌ITS序 2%~-10%NaCl的BPDA培养基上能生长;菌株BM-列与待测菌株MMIL-1的ITS序列构建系统发育 03能利用乳糖,在加入10%NaCl的BPDA培养基上树,发现MMIL-1菌株与哈茨木霉位于一个分支 不能生长。表明菌株BM-01和BM-03的生理生化上,相似度最高(图2)。结合形态鉴定结果,将菌株 特征与芽胞杆属细菌接近。 MMTL-1鉴定为哈茨木霉Thr= ranum Trichoderma aureoviride(HQ596956) Trichoderma harzianum(KY225675 Trichoderma aureoviride(FJ610307) 0.001 14 Trichoderma harzianum(FJ442645) Trichoderma afroharzianum(KX357834) Trichoderma harzianum(AF055215) Trichoderma harzianum(KY225671) Trichoderma harzianum(KR86824 Trichoderma harzianum(AF278790) 2基于IIS序列构建菌株MMTL-1与其相关菌株的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic analysis of strain MMTL-I and other related strains based on the ITS sequences 菌株BM1和BM03的gB扩增片段约为度较高的芽胞杆菌gB序列与待测菌株BM01 1200bp,经过序列比对发现与解淀粉芽胞杆菌B.BM-03的grB序列构建系统发育树,发现菌株BM- amyloliquefaciens、甲基营养型芽胞杆菌B. methyl-01和BM03与解淀粉芽胞杆菌位于一个分支上,相 opticus、贝菜斯芽胞杆菌B. pelewensis等菌株的似度最高(图3)。结合形态和生理生化鉴定结果 gB序列相似度都在9800%以上,选取12株相似将菌株BM-01和BM-03鉴定为解淀粉芽胞杆菌。 Bacillus amyloliquefaciens (JQ658430) Bacillus velezensis( CP01541 7) 100BM-0 Bacillus amyloliquefaciens(JNO86139.1) Bacillus amyloliquefaciens(CP013727) Bacillus velezensis(CP0225: Bacillus velezensis(LC191187) 55 Bacillus velezensis(CP022654 62 Bacillus velezensis(CP015443) 64 Bacillus methylotrophus( CPO1 1937) o Bacillus velezensis( CP018007) 3基于gB基因序列构建菌株BM-01和BM03与其相关菌株的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic analysis of strains BM-01, BM-03 and other related strains based on the gyrB gene sequences 3讨论 映木美土里复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防 效果,结果表明该菌剂对海棠苗的株高、茎粗、重量、 目前,关于苹果再植病害的生防效果指标缺乏叶面积等生长指标均有促进作用,且对苹果再植病 统一的标准,田间试验中多将新枝伸长长度、干重、的防治效果显著,显著优于常用于防治土传病害的 茎粗增量、株高及果实中各物质含量作为测量指标化学药剂恶霉灵(庄敬华等,2005),这在生产中较罕 ( Manic et al,2013; Liu et al,2014)。本研究选择见。分析可能的原因有2个,一是盆栽土壤环境相 株高、茎粗、干重、鲜重及叶面积等生长势指标来反对于大田比较简单,有利于木美土里复合微生物菌1期 赵 璐等：复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 213 2.4.2 细菌BM-01和BM-03的生理生化鉴定结果 细菌菌株 BM-01、BM-03 能发酵葡萄糖、麦芽 糖，硝酸盐还原反应生成红色化合物，可水解淀粉， 明胶液化呈阳性，L-阿拉伯糖、甘露醇呈阳性，脂酶 测定、甲基红试验、吲哚反应呈阴性，V-P测定能生 成红色化合物。菌株BM-01不能利用乳糖，在加入 2%~10% NaCl的BPDA培养基上能生长；菌株BM- 03能利用乳糖，在加入10% NaCl的BPDA培养基上 不能生长。表明菌株BM-01和BM-03的生理生化 特征与芽胞杆属细菌接近。 2.4.3 分子生物学鉴定结果 从菌株MMTL-1基因组DNA中扩增出约500 bp 的ITS片段，经过序列对比与哈茨木霉Trichoderma harzianum、黄绿木霉 T. aureoviride、非洲哈茨木霉 T. afroharzianum 等 菌 株 ITS 序 列 的 相 似 度 都 在 99.00%以上，选取10株相似度较高的木霉菌ITS序 列与待测菌株 MMTL-1 的 ITS 序列构建系统发育 树，发现 MMTL-1 菌株与哈茨木霉位于一个分支 上，相似度最高（图2）。结合形态鉴定结果，将菌株 MMTL-1鉴定为哈茨木霉T. harzianum。 图2 基于ITS序列构建菌株MMTL-1与其相关菌株的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic analysis of strain MMTL-1 and other related strains based on the ITS sequences 菌株 BM-01 和 BM-03 的 gyrB 扩增片段约为 1 200 bp，经过序列比对发现与解淀粉芽胞杆菌 B. amyloliquefaciens、甲基营养型芽胞杆菌 B. methylo￾trophicus、贝莱斯芽胞杆菌 B. velezensis 等菌株的 gyrB 序列相似度都在 98.00% 以上，选取 12 株相似 度较高的芽胞杆菌 gyrB 序列与待测菌株 BM-01、 BM-03的gyrB序列构建系统发育树，发现菌株BM- 01和BM-03与解淀粉芽胞杆菌位于一个分支上，相 似度最高（图 3）。结合形态和生理生化鉴定结果， 将菌株BM-01和BM-03鉴定为解淀粉芽胞杆菌。 图3 基于gyrB基因序列构建菌株BM-01和BM-03与其相关菌株的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic analysis of strains BM-01，BM-03 and other related strains based on the gyrB gene sequences 3 讨论 目前，关于苹果再植病害的生防效果指标缺乏 统一的标准，田间试验中多将新枝伸长长度、干重、 茎粗增量、株高及果实中各物质含量作为测量指标 （Manici et al.，2013；Liu et al.，2014）。本研究选择 株高、茎粗、干重、鲜重及叶面积等生长势指标来反 映木美土里复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防 效果，结果表明该菌剂对海棠苗的株高、茎粗、重量、 叶面积等生长指标均有促进作用，且对苹果再植病 的防治效果显著，显著优于常用于防治土传病害的 化学药剂恶霉灵（庄敬华等，2005），这在生产中较罕 见。分析可能的原因有2个，一是盆栽土壤环境相 对于大田比较简单，有利于木美土里复合微生物菌