张俊琪、等细菌学综合性实验在《医学微生物学》教学中的应用效果分析 表5综合性教学实验改革“人体肠道杆菌的分离与鉴定”问卷调查 Tab. 5 Survey and analysis of the comprehensive experiment teaching reform Option 1 0) Option 2 0) Option 3 0) I Resource of feces sample From students (100) From others (0) 2 Basic experimental skills training for Enhanced (94. 4) Not bad (15. 6) No help(o) microbiology 3 Basic experimental skills training for Enhanced(94. 4) Not bad (15. 6) No help (0) molecular biology Applications in future work Very applicable(88.9) Applicable (ll. 1) Inapplicable (0) 5 Stimulating students' interest in Yes(91.7) A little (8 3) No(0) Medical Microbiology studies 3讨论 在实验方法上,引入目前已在微生物鉴定方面 得到广泛应用的16 SrrNA基因序列分析技术。传 在实验设计上,选择学生自己的粪便标本作为统的细菌鉴定主要是通过表型特征来鉴定,通过分 分离鉴定的目标具有以下优点:①作为人体肠离培养、染色镜检、菌落形态观察、生化反应特征、抗 道正常菌群的重要组成部分,粪便中含有相当数量原分型等一系列实验后综合分析得到结果,虽然广 和种类的肠道杆菌,采用麦康凯平板进行分离培养泛应用于病原菌检测,但存在费时费力、灵敏度低等 成功率很高,适用于教学实验。实验操作分析也证缺点。16 S rRNA序列存在于所有细菌的基因组 实,12份标本全部分离获得细菌。②粪便标本取材中,全长约15kb,大小适中,既有高度保守的序列 方便,无痛苦,易于保存。③对取自于自己的标本进也有高度特异性序列,充分体现了不同菌属、菌种之 行分离鉴定,强烈激发了学生的好奇心和学习兴趣。间的差异,成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工 在实验操作上,整个实验过程包括平板划线、肉具。随着PCR和核酸研究技术的不断发展,数据库 汤接种、分光光度法测定菌液密度、细菌基因组提的不断完善,其在快速、微量、准确分类鉴定和检测 取、PCR扩增及扩增产物分离与纯化、DNA片段测病原菌方面将发挥越来越大的作用。在本实验中 序前TA克隆、16 S TRNA核苷酸序列分析、药敏试利用16 S TRNA基因保守区的通用引物27F和 验等技术的综合运用,强化了学生对医学微生物学1492R,PCR扩增获得细菌样本中1.45kb的 和分子生物学基本操作技术的训练,帮助其系统回16 SrrNA基因片段,测序后将核苷酸序列与 顾细菌分离和鉴定的全过程,为今后独立从事相应 GenBank数据库比对分析,达到快速鉴定细菌的目 的医药卫生工作和科学研究工作奠定了扎实的的。16 SrrNA序列分析方法敏感、快速、可靠性 基础 高、重现性强,能弥补传统方法的不足0。通过 在实验材料上,继续引入临床常用的API10S“人体肠道杆菌的分离与鉴定”的系统过程,从传统 革兰阴性细菌生化反应鉴定条。API微生物生化鉴的分离纯化和生化鉴定到现代分子生物学的16S 定系统以微生物生化理论为基础,是目前全球微生 TRNA PCR扩增和核酸序列测定,让学生既学习和 物鉴定的“金标准”。它借助于微生物对各种生理条理解了传统细菌学分类鉴定方法,又对现代分子生 件、生化指标及代谢反应进行分析,将结果转化为软物学技术在细菌分类鉴定中的应用有了深刻认识, 件可识别的数据来进行聚类分析,并与已知的菌种达到举一反三、触类旁通的目的。 数据库比对,最终对未知细菌进行鉴定。目前已有 本实验特点是将单个小型实验组合成为系统性 约600种细菌可被鉴定。与传统方法相比,API鉴综合性实验,将单一的示教性实验转变为探究性和 定系统结果判断客观,准确可靠,且操作简单方便,实用性实验,实现了从侧重获取知识的教育向增强 是临床广泛采用的细菌鉴定标准。API10S革兰阴创造性教育的转变。实验更新了传统的知识体系, 性细菌生化反应鉴定条的引入切实做到了理论与实真正做到了理论联系实际、基础结合临床。同时,该 践、基础与临床的有机结合。 实验也增加了学生的动手机会,激发了其学习热情,表 5 综合性教学实验改革“人体肠道杆菌的分离与鉴定”问卷调查 Tab ．5 Survey and analysis of the comprehensive experiment teaching reform No ． Item Option 1 （％ ） Option 2 （％ ） Option 3 （％ ） 1 Resource of feces sample From students （100） From others （0） — N 2 Basic experimental skills training for N microbiology Enhanced （94 ．4） Not bad （15 ．6） No help （0） K 3 Basic experimental skills training for N molecular biology Enhanced （94 ．4） Not bad （15 ．6） No help （0） K 4 Applications in future work Very applicable （88 ．9） Applicable （11 ．1） Inapplicable （0） N蝌鞍 5 Stimulating students’ interest in N Medical Microbiology studies Yes （91 ．7） A little （8 ．3） No （0） � 3 讨论 在实验设计上 ，选择学生自己的粪便标本作为 分离鉴定的目标具有以下优点［4 ，5］ ：① 作为人体肠 道正常菌群的重要组成部分 ，粪便中含有相当数量 和种类的肠道杆菌 ，采用麦康凯平板进行分离培养 成功率很高 ，适用于教学实验 。 实验操作分析也证 实 ，12 份标本全部分离获得细菌 。 ② 粪便标本取材 方便 ，无痛苦 ，易于保存 。 ③ 对取自于自己的标本进 行分离鉴定 ，强烈激发了学生的好奇心和学习兴趣 。 在实验操作上 ，整个实验过程包括平板划线 、肉 汤接种 、分光光度法测定菌液密度 、细菌基因组提 取 、PCR 扩增及扩增产物分离与纯化 、DNA 片段测 序前 TA 克隆 、16S rRNA 核苷酸序列分析 、药敏试 验等技术的综合运用 ，强化了学生对医学微生物学 和分子生物学基本操作技术的训练 ，帮助其系统回 顾细菌分离和鉴定的全过程 ，为今后独立从事相应 的医药卫生工作和科学研究工作奠定了扎实的 基础 。 在实验材料上 ，继续引入临床常用的 API 10S 革兰阴性细菌生化反应鉴定条 。 API 微生物生化鉴 定系统以微生物生化理论为基础 ，是目前全球微生 物鉴定的“金标准” 。 它借助于微生物对各种生理条 件 、生化指标及代谢反应进行分析 ，将结果转化为软 件可识别的数据来进行聚类分析 ，并与已知的菌种 数据库比对 ，最终对未知细菌进行鉴定 。 目前已有 约 600 种细菌可被鉴定 。 与传统方法相比 ，API 鉴 定系统结果判断客观 ，准确可靠 ，且操作简单方便 ， 是临床广泛采用的细菌鉴定标准 。 API 10S 革兰阴 性细菌生化反应鉴定条的引入切实做到了理论与实 践 、基础与临床的有机结合 。 在实验方法上 ，引入目前已在微生物鉴定方面 得到广泛应用的 16S rRNA 基因序列分析技术 。 传 统的细菌鉴定主要是通过表型特征来鉴定 ，通过分 离培养 、染色镜检 、菌落形态观察 、生化反应特征 、抗 原分型等一系列实验后综合分析得到结果 ，虽然广 泛应用于病原菌检测 ，但存在费时费力 、灵敏度低等 缺点 。 16S rRNA 序列存在于所有细菌的基因组 中 ，全长约1 ．5 kb ，大小适中 ，既有高度保守的序列 也有高度特异性序列 ，充分体现了不同菌属 、菌种之 间的差异 ，成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工 具 。 随着 PCR 和核酸研究技术的不断发展 ，数据库 的不断完善 ，其在快速 、微量 、准确分类鉴定和检测 病原菌方面将发挥越来越大的作用 。 在本实验中 ， 利用 16S rRNA 基因保守区的通用引物 27F 和 1492R［6‐8 ］ ，PCR 扩增获得细菌样本中1 ．45 kb 的 16S rRNA 基因 片段 ，测 序 后 将 核 苷 酸 序 列 与 GenBank 数据库比对分析 ，达到快速鉴定细菌的目 的 。 16S rRNA 序列分析方法敏感 、快速 、可靠性 高 、重现性强 ，能弥补传统方法的不足［9 ，10］ 。 通过 “人体肠道杆菌的分离与鉴定”的系统过程 ，从传统 的分离纯化和生化鉴定到现代分子生物学的 16S rRNA PCR 扩增和核酸序列测定 ，让学生既学习和 理解了传统细菌学分类鉴定方法 ，又对现代分子生 物学技术在细菌分类鉴定中的应用有了深刻认识 ， 达到举一反三 、触类旁通的目的 。 本实验特点是将单个小型实验组合成为系统性 综合性实验 ，将单一的示教性实验转变为探究性和 实用性实验 ，实现了从侧重获取知识的教育向增强 创造性教育的转变 。 实验更新了传统的知识体系 ， 真正做到了理论联系实际 、基础结合临床 。 同时 ，该 实验也增加了学生的动手机会 ，激发了其学习热情 ， 张俊琪 ，等 ：细菌学综合性实验在枟医学微生物学枠教学中的应用效果分析 · 369 ·