3.CRISPR/Cas9基因组编辑技术 CRISPR/Cas系统由Cas9核酸内切酶与sgRNA构成.转录的SgRNA折叠成特定的三 维结构后与Cas9蛋白形成复合体，指导Cas9核酸内切酶识别特定靶标位点，在P4M 序列上游处切割DNA造成双链DNA断裂，并启动DNA损伤修复机制.从不同菌种中 分离的CRISPR/Cas系统，其CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同， PAM序列也可能不同。最新报道，CRISPR-C2c2系统能够根据靶向序列特异地编辑单 链RNA. 三、 三种编辑技术的比较 1.共同点 结构的相似性：无论是ZFN、TALEN还是CRISPR/Cas9,都是由DNA识别域和 核酸内切酶两部分组成。其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA,而TALEN 的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为FON的核酸 内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA,Cas9蛋白负责DNA 的剪切。当DNA结合域识别靶点DNA序列后，核酸纳切酶或Cas9蛋白将DNA剪切 靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。 作用过程的相似性：通过DNA识别模块对特异性的DNA位点识别并结合，然 后在相关核酸内切酶的作用下完成特定位点的剪切，从而借助于细胞内固有的HD (同源定向修复)或NHE(非同源末端连接)途径修复过程完成特定序列的插入、删 除及基因融合。 2.不同点 三种基因编辑技术的差异 ZFN TALEN CRISRP系统 识别模式 蛋白质一DNA 蛋白质一DNA RNA-DNA 靶向元件 ZF array蛋白 TALE array蛋白 sgRNA蛋白 切割元件 FOkI蛋白 FOkI蛋白 Cas9蛋白 识别长度 (3-6)×3×2bp (12-20)×2bp 20bp 识别序列特点 以3bp为单位 5前一位为T 3'序列为NGC 213 2 / 3 3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术 CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与 sgRNA 构成. 转录的 sgRNA 折叠成特定的三 维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中 分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的 sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。最新报道，CRISPR-C2c2 系统能够根据靶向序列特异地编辑单 链 RNA。 三、 三种编辑技术的比较 1.共同点 结构的相似性：无论是 ZFN、TALEN 还是 CRISPR /Cas9，都是由 DNA 识别域和 核酸内切酶两部分组成。其中 ZFN 技术具有锌指结构域能够识别靶点 DNA，而 TALEN 的 DNA 识别区域是重复可变双残基的重复，DNA 剪切区域都是一种名为 Fokl 的核酸 内切酶结构域。CRISPR 的 DNA 识别区域是 crRNA 或向导 RNA，Cas9 蛋白负责 DNA 的剪切。当 DNA 结合域识别靶点 DNA 序列后，核酸内切酶或 Cas9 蛋白将 DNA 剪切， 靶 DNA 双链断裂，再启动 DNA 损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。 作用过程的相似性：通过ＤＮＡ识别模块对特异性的ＤＮＡ位点识别并结合，然 后在相关核酸内切酶的作用下完成特定位点的剪切，从而借助于细胞内固有的 HDR （同源定向修复）或 NHEJ（非同源末端连接）途径修复过程完成特定序列的插入、删 除及基因融合。 2.不同点 三种基因编辑技术的差异 ZFN TALEN CRISRP 系统 识别模式 蛋白质—DNA 蛋白质—DNA RNA—DNA 靶向元件 ZF array 蛋白 TALE array 蛋白 sgRNA 蛋白 切割元件 Fok I 蛋白 Fok I 蛋白 Cas9 蛋白 识别长度 （3-6）x 3 x 2 bp (12-20) x 2 bp 20 bp 识别序列特点 以 3 bp 为单位 5‘前一位为 T 3‘序列为 NGC