酶);(2)对酶基因进行修饰,产生遗传修饰酶(突变酶):(3)设计新的酶基因,合成自然界不曾有过的、性 能稳定、催化效率更高的新酶。 酶基因的克隆和表达技术的应用使克隆各种天然的蛋白基因或酶基因成为可能。先在特定酶的结构 基因前加上高效的启动基因序列和必要的调控序列,再将此片断克隆到一定的载体中,然后带有特定酶 基因的上述杂交表达载体转化到适当的受体细菌中,经培养繁殖,分离得到大量的表达产物—一目标 酶。一些来自于人体的酶制剂,如治疗血栓栓塞病的尿激酶原,就可以用此法取代从大量的人尿中提 取 还可采用生物技术对酶蛋白进行选择性遗传修饰,即酶基因的定点突变。在分析氨基酸序列弄清酶 的一级结构及X射线衍射分析弄清酶的空间结构的基础上,由功能推知结构或由结构推知功能,设计出 酶基因的改造方案,确定选择性遗传修饰位点,就能人工合成出所设计的酶基因。用于生产昂贵、特殊 的药品和生物制品,以满足人类的特殊需要 需要改善的酶学性质包括:对热、氧化剂、非水溶剂的稳定性;对蛋白水解作用的敏感性;免疫原 性;最适pl、离子强度及温度;催化效率;对底物和辅助因子的专一性与亲合力;反应的立体化学选择 性:催化效率;别构效应;反馈抑制;多功能性;在纯化或固定化过程中酶的功能和理化性质等。 第十节酶的分离提纯及活力测定 、酶的分离提纯 对酶进行分离提纯有两方面的目的。一是为了研究酶的理化特性,对酶进行鉴定,必须要用纯酶, 二是作为生化试剂及工业用酶,常常也要求有较高的纯度。在食品工业中使用的一些酶制剂及来源列于 表5-4。 根据酶在体内作用的部位,可以将酶分为胞外酶及胞内酶两大类。胞外酶易于分离,如收集动物胰 液即可分离出其中的各种蛋白酶及酯酶等。胞内酶存在于细胞内,必须破碎细胞才能进行分离。分离提 纯步骤简述于下: 1、选材应选择酶含量高、易于分离的动、植物组织或微生物材料作原料。 破碎细胞动物细胞较易破碎,通过一般的硏磨器、匀浆器、捣碎机等就可破碎。 细菌细胞具有较厚的细胞壁,较难破碎,需要用超声波、细菌磨、溶菌酶、某些化学溶剂(如甲 苯、脱氧胆酸钠)或冻融等处理加以破 植物细胞因为有较厚的细胞壁,也较难破碎 3、抽取在低温下,用水或低盐缓冲液,从已破碎的细胞中将酶溶出。这样所得到的粗提液中往 往含有很多杂蛋白质及核酸、多糖等成分。 4、分离及提纯根据酶是蛋白质这一特性,用一系列提纯蛋白质的方法,如盐析(用硫酸铵或氯化 钠)、调节pH、等电点沉淀、有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇等)分级分离等法提纯。 酶是生物活性物质,在提纯时必须考虑尽量减少酶活力的损失,因此全部操作需在低温下进行 般在0~5℃间进行,用有机溶剂分级分离时必须在-15~20℃下进行。为防止重金属使酶失活,有时需在 抽提溶剂中加入少量EDTA作螯合剂:为了防止酶蛋白一SH基被氧化失活,需要在抽提溶剂中加入少量 巯基乙醇。在整个分离提纯过程中不能过度搅拌,以兔产生大量泡沫,而使酶变性。 在分离提纯过程中,必须经常测定酶的比活力,以指导提纯工作正确进行。 若要得到纯度更高的制品,还需进一步提纯,常用的方法有磷酸钙凝胶吸附、离子交换纤维素(如 DEAE纤维素)分离、葡聚糖凝胶层析、离子交换一葡聚糖凝胶层析、凝胶电泳分离及亲和层析分离 5、保存最后需将酶制品浓缩、结晶,以便于保存。酶制品一般都应在-20℃以下低温保存,常用 含有少量巯基乙醇或二硫苏糖醇的甘油作保存溶剂。 酶很易失活,绝不用高温烘干,可用的方法是:(1)保存浓缩的酶液:用硫酸铵沉淀或硫酸铵反透 析法使酶浓缩,使用前再透析除去硫酸铵。(2)冰冻干燥:对于已除去盐分的酶液可以先在低温结冻, 再减压使水分升华,制成酶的干粉,保存于冰箱中。(3)浓缩液加入等体积甘油,于-20℃下保存。 、酶活力的测定 酶活力也称为酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。 检查酶的含量及存在,不能直接用重量或体积来表示,常用它催化某一特定反应的能力来表示,即 用酶的活力来表示。酶活力的高低是研究酶的特性、进行酶制剂的生产及应用时的一项必不可少的指 标酶)；(2)对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶(突变酶)；(3)设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、性 能稳定、催化效率更高的新酶。 酶基因的克隆和表达技术的应用使克隆各种天然的蛋白基因或酶基因成为可能。先在特定酶的结构 基因前加上高效的启动基因序列和必要的调控序列，再将此片断克隆到一定的载体中，然后带有特定酶 基因的上述杂交表达载体转化到适当的受体细菌中，经培养繁殖 ，分离得到大量的表达产物——目标 酶。一些来自于人体的酶制剂，如治疗血栓栓塞病的尿激酶原，就可以用此法取代从大量的人尿中提 取。 还可采用生物技术对酶蛋白进行选择性遗传修饰，即酶基因的定点突变。在分析氨基酸序列弄清酶 的一级结构及 X 射线衍射分析弄清酶的空间结构的基础上，由功能推知结构或由结构推知功能，设计出 酶基因的改造方案，确定选择性遗传修饰位点，就能人工合成出所设计的酶基因。用于生产昂贵、特殊 的药品和生物制品，以满足人类的特殊需要。 需要改善的酶学性质包括：对热、氧化剂、非水溶剂的稳定性；对蛋白水解作用的敏感性；免疫原 性；最适 pH、离子强度及温度；催化效率；对底物和辅助因子的专一性与亲合力；反应的立体化学选择 性；催化效率；别构效应；反馈抑制；多功能性；在纯化或固定化过程中酶的功能和理化性质等。 第十节 酶的分离提纯及活力测定 一、酶的分离提纯 对酶进行分离提纯有两方面的目的。一是为了研究酶的理化特性，对酶进行鉴定，必须要用纯酶， 二是作为生化试剂及工业用酶，常常也要求有较高的纯度。在食品工业中使用的一些酶制剂及来源列于 表 5-4。 根据酶在体内作用的部位，可以将酶分为胞外酶及胞内酶两大类。胞外酶易于分离，如收集动物胰 液即可分离出其中的各种蛋白酶及酯酶等。胞内酶存在于细胞内，必须破碎细胞才能进行分离。分离提 纯步骤简述于下： 1、选材 应选择酶含量高、易于分离的动、植物组织或微生物材料作原料。 2、破碎细胞 动物细胞较易破碎，通过一般的研磨器、匀浆器、捣碎机等就可破碎。 细菌细胞具有较厚的细胞壁，较难破碎，需要用超声波、细菌磨、溶菌酶、某些化学溶剂（如甲 苯、脱氧胆酸钠）或冻融等处理加以破碎。 植物细胞因为有较厚的细胞壁，也较难破碎。 3、抽取 在低温下，用水或低盐缓冲液，从已破碎的细胞中将酶溶出。这样所得到的粗提液中往 往含有很多杂蛋白质及核酸、多糖等成分。 4、分离及提纯 根据酶是蛋白质这一特性，用一系列提纯蛋白质的方法，如盐析（用硫酸铵或氯化 钠）、调节 pH、等电点沉淀、有机溶剂（乙醇、丙酮、异丙醇等）分级分离等法提纯。 酶是生物活性物质，在提纯时必须考虑尽量减少酶活力的损失，因此全部操作需在低温下进行。一 般在 0~5℃间进行，用有机溶剂分级分离时必须在－15~20 ℃下进行。为防止重金属使酶失活，有时需在 抽提溶剂中加入少量 EDTA 作螯合剂；为了防止酶蛋白—SH 基被氧化失活，需要在抽提溶剂中加入少量 巯基乙醇。在整个分离提纯过程中不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，而使酶变性。 在分离提纯过程中，必须经常测定酶的比活力，以指导提纯工作正确进行。 若要得到纯度更高的制品，还需进一步提纯，常用的方法有磷酸钙凝胶吸附、离子交换纤维素（如 DEAE-纤维素）分离、葡聚糖凝胶层析、离子交换－葡聚糖凝胶层析、凝胶电泳分离及亲和层析分离 等。 5、保存 最后需将酶制品浓缩、结晶，以便于保存。酶制品一般都应在－20℃以下低温保存，常用 含有少量巯基乙醇或二硫苏糖醇的甘油作保存溶剂。 酶很易失活，绝不用高温烘干，可用的方法是：（1）保存浓缩的酶液：用硫酸铵沉淀或硫酸铵反透 析法使酶浓缩，使用前再透析除去硫酸铵。（2）冰冻干燥：对于已除去盐分的酶液可以先在低温结冻， 再减压使水分升华，制成酶的干粉，保存于冰箱中。（3）浓缩液加入等体积甘油，于－20 ℃下保存。 二、酶活力的测定 酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。 检查酶的含量及存在，不能直接用重量或体积来表示，常用它催化某一特定反应的能力来表示，即 用酶的活力来表示。酶活力的高低是研究酶的特性、进行酶制剂的生产及应用时的一项必不可少的指 标。 126