·1270 北京科技大学学报 第35卷 岭石矿样5g,培养7d后，上清液中SiO2的质量 隔1d取上清液样测定SiO2的质量浓度：菌株的 浓度可达到50mgL-1左右，表明该菌株具有较高 生长稳定期通过对细菌在装有不含矿样的纯发酵液 的分解铝硅酸盐矿物能力，并能释放其中的硅 体培养基的锥型瓶，在以上同样条件下培养测定. 1.3细菌诱变与筛选 诱变菌株的遗传稳定性测定：将筛选出的相对 实验菌株在胶质芽孢杆菌改性培养基（专性培 较高脱硅能力的菌株在含铝土矿的液体培养基中连 养基+(NH4)2SO4)中扩大培养至对数生长期，将菌 续培养7代，并分别于第1代、第4代、第7代测 液在5000r~min-1条件下离心分离20min,去上清 定培养液中的SO2的质量浓度，考察诱变菌株脱 液，收集菌体，然后用无菌水制备成菌悬浮液，菌 硅能力的稳定性 体数量控制在107~10°mL-1 1.4铝土矿细菌浸矿实验 紫外(UV)诱变：将制备好的菌悬浮液进行梯 在250mL锥型瓶中装入90mL的胶质芽孢 度稀释，然后各取1L涂布于固体培养基平板 杆菌专性培养基，接入对数生长期未诱变的HJ07 上，30℃下静置培养直至长出菌落，选取平板上 菌株菌液与诱变后H,J07菌株菌液（细菌初始浓度 菌落数为100200的稀释浓度作为最佳稀释浓度. 1×106mL-1),矿浆质量浓度45gL-1，在30℃、 取最佳稀释浓度的菌悬液进行平板涂布后，将放入 初始pH值为7.0、转速为200rmin-1条件下连续 该平板的培养皿中置于距30W紫外灯30cm处分 培养12d,定期测定上清液中的细菌数量、pH值、 别照射30、60、120、180和240s,照射结束后立即 黏度与SO2的质量浓度 将诱变菌液在4℃下避光保存12h.同时，设立未 1.5测试方法 经紫外线照射的HJ07菌株作为平行对照组.将实 上清液中SiO2的浓度采用硅钼蓝分光光度法 验组与对照组平板均在30℃条件下静置培养20h, (721E分光光度仪)测定：pH值用PHS-3C型pH计 观察实验组与对照组平板菌落数，实验组再生菌落 测定：浸矿上清液黏度用黏度计测定，仪器型号为 计数为N,对照组再生菌落计数为M,计算诱变致 NDJ-4:细菌培养液及浸矿上清液中的细菌数量在 死率 XS-212生物显微镜下用平板计数法测定：对细菌浸 a =M-N 出12d后的铝土矿浸渣用20%烧碱溶液和去离子 ×100%. M 水进行清洗，目的清除吸附在浸渣表面的细菌聚集 亚硝基胍(NTG)诱变：取菌悬浮液10mL,分 体及黏性大分子代谢产物，然后用扫描电镜(SEM) 别加入装有90mL含不同质量浓度(0、300、500、600 与能谱(EDS)观察细菌浸出前后铝土矿的表面微观 和700mgL-1)NTG的改性培养基的250mL锥型 形态变化：浸矿培养12d后，从浸出液下部取一滴 瓶中，在30℃、200rmin-1条件下处理40min,然 细菌-矿物复合体样品置于直径5mm的载玻片上， 后离心分离，并用无菌水洗涤三次，除去NTG,终 在超净工作台中自然晾干后（目的是保留浸渣表面 止诱变.然后取各诱变菌液1mL稀释涂布于改性 的生物聚集体与生物膜)，用扫描电镜分析细菌- 培养基琼脂平板上，30℃下培养48h后进行菌落 矿物相互作用过程中表面微观形态：将少量干燥矿 计数，计算致死率，确定最佳诱变剂量并挑取该诱 样样品放在研钵中研磨到粒度为74m,然后进行 变剂量下的菌落进行筛选 X射线衍射（日本Rigaku D/Max-RB型X射线衍 诱变菌株的筛选：①初筛.将HJ07菌株经紫外 射仪)定性分析样品中的矿物组成，并用“K”值 与NTG诱变后且致死率在70%90%的菌液进行后 法【计算出样品中各主要矿物的质量分数：铝土 培养，挑选其中出现较早、生长速度较快且形态不 矿细菌脱硅效率(e)的计算公式为 同的再生菌落接种于琼脂平板上，30℃培养48h, A 长出菌落后，与未经诱变的出发菌株的菌落形态进 e=B×100%. 行比较，选取直径与圆润度比出发菌株更大的菌株 式中，A为浸出液中SO2总质量，B为相同质量原 进一步复筛.②复筛.H07菌株的正突变率由传代 矿样中SiO2总质量. 时间或生长稳定期与对铝硅酸盐矿物的脱硅效率共 2结果与讨论 同确定.菌株的传代时间按照文献[28]方法确定： 菌株的脱硅效率通过装有90L胶质芽孢杆菌改 2.1紫外照射时间与NTG诱变剂质量浓度的确定 性培养基+5g高岭土矿粉的250mL锥型瓶中进 采用不同的紫外线照射时间与不同浓度NTG 行培养测定，实验条件同1.2节.在培养过程中，每 诱变剂对菌株HJ07进行诱变处理，所得菌株的致· 1270 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 35 卷 岭石矿样 5 g，培养 7 d 后，上清液中 SiO2 的质量 浓度可达到 50 mg·L −1 左右，表明该菌株具有较高 的分解铝硅酸盐矿物能力，并能释放其中的硅. 1.3 细菌诱变与筛选 实验菌株在胶质芽孢杆菌改性培养基 (专性培 养基 +(NH4)2SO4) 中扩大培养至对数生长期，将菌 液在 5000 r·min−1 条件下离心分离 20 min，去上清 液，收集菌体，然后用无菌水制备成菌悬浮液，菌 体数量控制在 107 ∼108 mL−1 . 紫外 (UV) 诱变：将制备好的菌悬浮液进行梯 度稀释，然后各取 1 mL 涂布于固体培养基平板 上，30 ℃下静置培养直至长出菌落，选取平板上 菌落数为 100∼200 的稀释浓度作为最佳稀释浓度. 取最佳稀释浓度的菌悬液进行平板涂布后，将放入 该平板的培养皿中置于距 30 W 紫外灯 30 cm 处分 别照射 30、60、120、180 和 240 s，照射结束后立即 将诱变菌液在 4 ℃下避光保存 12 h. 同时，设立未 经紫外线照射的 HJ07 菌株作为平行对照组. 将实 验组与对照组平板均在 30 ℃条件下静置培养 20 h， 观察实验组与对照组平板菌落数，实验组再生菌落 计数为 N，对照组再生菌落计数为 M，计算诱变致 死率 α = M − N M × 100%. 亚硝基胍 (NTG) 诱变：取菌悬浮液 10 mL，分 别加入装有 90 mL 含不同质量浓度 (0、300、500、600 和 700 mg·L −1 ) NTG 的改性培养基的 250 mL 锥型 瓶中，在 30 ℃、200 r·min−1 条件下处理 40 min，然 后离心分离，并用无菌水洗涤三次，除去 NTG，终 止诱变. 然后取各诱变菌液 1 mL 稀释涂布于改性 培养基琼脂平板上，30 ℃下培养 48 h 后进行菌落 计数，计算致死率，确定最佳诱变剂量并挑取该诱 变剂量下的菌落进行筛选. 诱变菌株的筛选：①初筛. 将 HJ07 菌株经紫外 与 NTG 诱变后且致死率在 70%∼90%的菌液进行后 培养，挑选其中出现较早、生长速度较快且形态不 同的再生菌落接种于琼脂平板上，30 ℃培养 48 h， 长出菌落后，与未经诱变的出发菌株的菌落形态进 行比较，选取直径与圆润度比出发菌株更大的菌株 进一步复筛. ②复筛. HJ07 菌株的正突变率由传代 时间或生长稳定期与对铝硅酸盐矿物的脱硅效率共 同确定. 菌株的传代时间按照文献 [28] 方法确定； 菌株的脱硅效率通过装有 90 mL 胶质芽孢杆菌改 性培养基 +5 g 高岭土矿粉的 250 mL 锥型瓶中进 行培养测定，实验条件同 1.2 节. 在培养过程中，每 隔 1 d 取上清液样测定 SiO2 的质量浓度；菌株的 生长稳定期通过对细菌在装有不含矿样的纯发酵液 体培养基的锥型瓶，在以上同样条件下培养测定. 诱变菌株的遗传稳定性测定：将筛选出的相对 较高脱硅能力的菌株在含铝土矿的液体培养基中连 续培养 7 代，并分别于第 1 代、第 4 代、第 7 代测 定培养液中的 SiO2 的质量浓度，考察诱变菌株脱 硅能力的稳定性. 1.4 铝土矿细菌浸矿实验 在 250 mL 锥型瓶中装入 90 mL 的胶质芽孢 杆菌专性培养基，接入对数生长期未诱变的 HJ07 菌株菌液与诱变后 HJ07 菌株菌液 (细菌初始浓度 1×106 mL−1 )，矿浆质量浓度 45 g·L −1，在 30 ℃、 初始 pH 值为 7.0、转速为 200 r·min−1 条件下连续 培养 12 d，定期测定上清液中的细菌数量、pH 值、 黏度与 SiO2 的质量浓度. 1.5 测试方法 上清液中 SiO2 的浓度采用硅钼蓝分光光度法 (721E 分光光度仪) 测定；pH 值用 PHS-3C 型 pH 计 测定；浸矿上清液黏度用黏度计测定，仪器型号为 NDJ-4；细菌培养液及浸矿上清液中的细菌数量在 XS-212 生物显微镜下用平板计数法测定；对细菌浸 出 12 d 后的铝土矿浸渣用 20%烧碱溶液和去离子 水进行清洗，目的清除吸附在浸渣表面的细菌聚集 体及黏性大分子代谢产物，然后用扫描电镜 (SEM) 与能谱 (EDS) 观察细菌浸出前后铝土矿的表面微观 形态变化；浸矿培养 12 d 后，从浸出液下部取一滴 细菌 - 矿物复合体样品置于直径 5 mm 的载玻片上， 在超净工作台中自然晾干后 (目的是保留浸渣表面 的生物聚集体与生物膜)，用扫描电镜分析细菌 - 矿物相互作用过程中表面微观形态；将少量干燥矿 样样品放在研钵中研磨到粒度为 74 µm，然后进行 X 射线衍射 (日本 Rigaku D/Max-RB 型 X 射线衍 射仪) 定性分析样品中的矿物组成，并用 “K” 值 法 [10] 计算出样品中各主要矿物的质量分数；铝土 矿细菌脱硅效率 (ε) 的计算公式为 ε = A B × 100%. 式中，A 为浸出液中 SiO2 总质量，B 为相同质量原 矿样中 SiO2 总质量. 2 结果与讨论 2.1 紫外照射时间与 NTG 诱变剂质量浓度的确定 采用不同的紫外线照射时间与不同浓度 NTG 诱变剂对菌株 HJ07 进行诱变处理，所得菌株的致