液态活检 肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，靶向治疗和免疫治疗显著提高了晚期肺癌患者 的无进展生存期和总生存期。靶向治疗的前提是明确患者的分子分型，常规的分子检测以肿 瘤组织为"金标准"[1)，采用原发灶或单一转移灶的肿瘤组织获取DNA或RNA来检测基因突 变。然而，肿瘤在各种内源性和外源性选择压力的作用下不断进化，肿瘤基因组分子图谱也 在动态变化，特别是经靶向药物治疗后，细胞亚克隆增加，异质性增强2]。此外，获取肿瘤 组织为有创操作，无法多时间点重复采样，且肿瘤组织存在时间和空间异质性，活检或穿刺 样本不能代表肿瘤病灶的全貌。因此，以外周血循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)为代表的"液态活检"受到了越来越多的关注。 液态活检是基于体液（如血液、尿液、唾液等）样本的一类非侵入性的检测方法，能够快捷 无创地进行疾病诊断或治疗监测。其概念最早由Sorrells[3)]于1974年提出，研究采用关节 腔内的滑液诊断滑膜炎。目前，液态活检技术已被用于肿痛诊断、指导靶向用药、监测疗效 和耐药等方面。本文将从液态活检的样本类型、检测方法、临床应用等方面加以论述。 1液态活检的样本类型及其生物学特征 1.1以外周血为基础的液态活检样本 肿瘤细胞在体内不断更新、坏死、脱落，将DNA、RNA、蛋白质等细胞成分乃至肿瘤细胞 释放至血液循环，因此，肿瘤患者的外周血中可含有ctDNA、循环肿瘤RNA(circulating tumo, RNA,CtRNA)、循环肿瘤细胞(ciruating tumocel,CTC)等，更关键的是这些介质携带 肿瘤基因组信息，能够反映肿瘤负荷及进展等情况。 (I)ctDNA:是指存在于外周血中且来源于肿瘤细胞的游离DNA。循环游离DNA (circulating free DNA,cfDNA)即非细胞结合的DNA,Mandel等4于1948年首次发现在 癌症患者的血液中存在非细胞结合核酸，即cfDNA。1977年，Leon等发现肿瘤患者外周 血cfDNA的含量明显高于非肿瘤患者，这一重大发现促进了后续一系列研究Stroun等[6] 首先发现肿瘤患者的CDNA携带肿瘤相关的基因变异，并相继被其他研究团队证实， cDNA包含了癌基因/抑癌基因的突变、微卫星不稳定、后生遗传学变异等基因变异信息 T-9]。因此，肿瘤患者外周血cfDNA一部分来自于肿瘤细胞，称之为ctDNA: cDNA进入体液循环的机制尚不清楚，一般认为可通过细胞凋亡、坏死或主动分泌等方式 将cfDNA释放至血液循环或其他体液系统[10-I5]。通过测序发现cfDNA片段大小集中 在166bp左右，为环绕核小体(147bp)及组蛋白H1接头DNA的长度之和[16,17。 而相对于非突变的cfDNA而言，CtDNA的长度短于cfDNA[18-21],通过大鼠移植瘤模型 分析发现ctDNA的长度为134~144bp[20],这种缩短的机制仍不清楚。而长度大于 1000bp的cDNA更可能来自于正常细胞，通过外泌体释放至血液循环，或者来自坏死肿 瘤细胞所释放的DNA片段。研究发现cfDNA的半衰期为16分钟至2.5小时[22-2]： 因此，cDNA的定量分析能够实时反映肿瘤的负荷大小。但受到半衰期短以及背景复杂的 影响，使得cDNA在外周血中的占比波动较大，在临床实践中需要灵敏度高的方法才能满 足ctDNA的检测需求。液态活检 肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，靶向治疗和免疫治疗显著提高了晚期肺癌患者 的无进展生存期和总生存期。靶向治疗的前提是明确患者的分子分型，常规的分子检测以肿 瘤组织为"金标准"[1]，采用原发灶或单一转移灶的肿瘤组织获取 DNA 或 RNA 来检测基因突 变。然而，肿瘤在各种内源性和外源性选择压力的作用下不断进化，肿瘤基因组分子图谱也 在动态变化，特别是经靶向药物治疗后，细胞亚克隆增加，异质性增强[2]。此外，获取肿瘤 组织为有创操作，无法多时间点重复采样，且肿瘤组织存在时间和空间异质性，活检或穿刺 样本不能代表肿瘤病灶的全貌。因此，以外周血循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）为代表的"液态活检"受到了越来越多的关注。 液态活检是基于体液（如血液、尿液、唾液等）样本的一类非侵入性的检测方法，能够快捷、 无创地进行疾病诊断或治疗监测。其概念最早由 Sorrells[3]于 1974 年提出，研究采用关节 腔内的滑液诊断滑膜炎。目前，液态活检技术已被用于肿瘤诊断、指导靶向用药、监测疗效 和耐药等方面。本文将从液态活检的样本类型、检测方法、临床应用等方面加以论述。 1 液态活检的样本类型及其生物学特征 1.1 以外周血为基础的液态活检样本 肿瘤细胞在体内不断更新、坏死、脱落，将 DNA、RNA、蛋白质等细胞成分乃至肿瘤细胞 释放至血液循环。因此，肿瘤患者的外周血中可含有 ctDNA、循环肿瘤 RNA（circulating tumor RNA，ctRNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）等，更关键的是这些介质携带 肿瘤基因组信息，能够反映肿瘤负荷及进展等情况。 （1）ctDNA ：是指存在于外周血中且来源于肿瘤细胞的游离 DNA。循环游离 DNA （circulating free DNA，cfDNA）即非细胞结合的 DNA，Mandel 等[4]于 1948 年首次发现在 癌症患者的血液中存在非细胞结合核酸，即 cfDNA。1977 年，Leon 等[5]发现肿瘤患者外周 血 cfDNA 的含量明显高于非肿瘤患者，这一重大发现促进了后续一系列研究。Stroun 等 [6] 首先发现肿瘤患者的 cfDNA 携带肿瘤相关的基因变异，并相继被其他研究团队证实， cfDNA 包含了癌基因 / 抑癌基因的突变、微卫星不稳定、后生遗传学变异等基因变异信息 [7-9]。因此，肿瘤患者外周血 cfDNA 一部分来自于肿瘤细胞，称之为 ctDNA。 cfDNA 进入体液循环的机制尚不清楚，一般认为可通过细胞凋亡、坏死或主动分泌等方式 将 cfDNA 释放至血液循环或其他体液系统 [10-15]。通过测序发现 cfDNA 片段大小集中 在 166 bp 左右，为环绕核小体（147 bp）及组蛋白 H1 接头 DNA 的长度之和 [16,17]。 而相对于非突变的 cfDNA 而言，ctDNA 的长度短于 cfDNA[18-21]，通过大鼠移植瘤模型 分析发现 ctDNA 的长度为 134 ～ 144 bp[20]，这种缩短的机制仍不清楚。而长度大于 1000 bp 的 cfDNA 更可能来自于正常细胞，通过外泌体释放至血液循环，或者来自坏死肿 瘤细胞所释放的 DNA 片段。研究发现 cfDNA 的半衰期为 16 分钟至 2.5 小时 [22-25]。 因此，ctDNA 的定量分析能够实时反映肿瘤的负荷大小。但受到半衰期短以及背景复杂的 影响，使得 ctDNA 在外周血中的占比波动较大，在临床实践中需要灵敏度高的方法才能满 足 ctDNA 的检测需求