干。短板灌胶面用海绵沾以100%乙醇擦净,待干。0.4mm厚的梳子、垫片( Spacer)洗净 后一并用乙醇拭净,待干。 灌胶架左侧一头撑起,右侧移件拉出。长玻璃板轻轻搁上,进岀水管靠近操作者。板 的两侧放上夹条,近移件端,将夹条长出一侧朝内,缺失一侧向外。夹条用夹子夹住边缘暂 固定。短板灌胶面向下,凹头轻轻搁在长板及夹条之上,平头搁在移件远侧 2)配制6%变性测序胶 5×TBE 12 ml 28.8g 水 48ml,加热磁力搅拌至尿素溶解,然后加入: 40%胶 9 ml 10%过硫酸铵 0.42ml 水→60ml,混匀,灌胶前再加入 四甲基乙二胺( TEMED)18uL 轻轻混匀后立刻灌胶。 轻轻倾倒胶至短板前的凹侧内,见凝胶渗抵长板下缘后,左手按短板前侧,右手托移 件之端,向前移动,速度以长板下缘凝胶不被带起,出现气泡和因移动过慢而泄漏:另一人 保持不断倾倒凝胶,以不溢出凹侧为度。待短板两侧突起抵长板及夹条上缘后,即刻放平灌 胶架,两侧用夹子夹紧,左侧前缘插入梳子。前后两侧包以保鲜膜,以防凝胶干燥。通常放 过尊以上介绍的是DNA测序工作站的灌胶方式,不同测序模具有不同的方法,比如由注 射器底部灌胶法、加样瓶上部灌胶法等。具体可以参考有关实验室相应仪器的说明书 3.电泳 1)预电泳 揭去模具两端的保鲜膜,将模具固定至电泳架上。接通模具上端与电泳架上端的恒温 水浴接头。上下缓冲液槽内注入1×TBE电泳缓冲液,各约1000m。轻轻拔去疏子,立即冲 洗上样孔。开启恒温水浴,温度设置在55℃。接通并开启电源,1500V预电泳半小时, 2)上样电泳 再次冲洗上样孔。自冰箱内取出样品,按G、A、T、C、G、A、T、C次序上样,每 孔上样2.5ul,每一样品分上样两孔。上样时,吸头插入上样孔内的上部,轻轻推入样品, 样品因比重较大,会自动沉入孔底。上样要轻而快,上样毕迅速开启电源电泳。电压调至 200ⅴ。电泳时间长短通常视拟测序列位置而定,如从起始部测起,当溴酚蓝抵达凝胶的下 三分之一时,即可停止电泳 4.干胶、曝光 1)干胶 放掉电泳缓冲液,卸下凝胶模具,轻轻撬起短玻璃板,撬时,左手抵住玻璃板对侧 以防玻璃板滑动,破坏凝胶。翻转玻璃,平置桌上。用略大于胶面的滤纸覆于胶上,轻轻按 平,使胶粘于滤纸之上。捏住胶上滤纸一角,轻轻揭起凝胶,胶面向上,放于干燥器滤纸之 上。开启凝胶干燥器,调至80℃,揭开盖膜,铺一张相冋同大小的滤纸于干燥面上(以防真 空干燥时,同位素透过粘于胶上的滤纸,污染干燥器:亦可防止干燥器上已污染的同位素反 过来再污染待干燥的凝胶,影响结果分析)。胶面盖以保鲜膜,开启真空泵,铺平保鲜膜 以免漏气。盖上盖膜。真空干燥80-100分钟。 2)曝光 于暗房内,打开暗盒,置ⅹ光胶片于增感屏上,将烘干的凝胶胶面朝ⅹ光片,盖上暗 盒。置暗盒于避光干燥处。曝光3天。常规冲片,视显影深浅延长或缩短曝光时间 5.读片 读片方法同前图示。参照引物之后部分已知序列,读出所测序列,并确认上样次序是 否有误 实验结果干。短板灌胶面用海绵沾以 100％乙醇擦净，待干。0.4mm 厚的梳子、垫片（Spacer）洗净 后一并用乙醇拭净，待干。 灌胶架左侧一头撑起，右侧移件拉出。长玻璃板轻轻搁上，进出水管靠近操作者。板 的两侧放上夹条，近移件端，将夹条长出一侧朝内，缺失一侧向外。夹条用夹子夹住边缘暂 固定。短板灌胶面向下，凹头轻轻搁在长板及夹条之上，平头搁在移件远侧。 2）配制 6％变性测序胶 5×TBE 12 ml 尿素 28.8 g 水 → 48 ml，加热磁力搅拌至尿素溶解，然后加入： 40％胶 9 ml 10％过硫酸铵 0.42 ml 水 → 60 ml，混匀，灌胶前再加入 四甲基乙二胺（TEMED） 18 ul 轻轻混匀后立刻灌胶。 3）灌胶 轻轻倾倒胶至短板前的凹侧内，见凝胶渗抵长板下缘后，左手按短板前侧，右手托移 件之端，向前移动，速度以长板下缘凝胶不被带起，出现气泡和因移动过慢而泄漏；另一人 保持不断倾倒凝胶，以不溢出凹侧为度。待短板两侧突起抵长板及夹条上缘后，即刻放平灌 胶架，两侧用夹子夹紧，左侧前缘插入梳子。前后两侧包以保鲜膜，以防凝胶干燥。通常放 过夜。 以上介绍的是 DNA 测序工作站的灌胶方式，不同测序模具有不同的方法，比如由注 射器底部灌胶法、加样瓶上部灌胶法等。具体可以参考有关实验室相应仪器的说明书。 3．电泳 1）预电泳 揭去模具两端的保鲜膜，将模具固定至电泳架上。接通模具上端与电泳架上端的恒温 水浴接头。上下缓冲液槽内注入 1×TBE 电泳缓冲液，各约 1000ml。轻轻拔去疏子，立即冲 洗上样孔。开启恒温水浴，温度设置在 55℃。接通并开启电源，1500V 预电泳半小时。 2）上样电泳 再次冲洗上样孔。自冰箱内取出样品，按 G、A、T、C、G、A、T、C 次序上样，每 孔上样 2.5ul，每一样品分上样两孔。上样时，吸头插入上样孔内的上部，轻轻推入样品， 样品因比重较大，会自动沉入孔底。上样要轻而快，上样毕迅速开启电源电泳。电压调至 2000V。电泳时间长短通常视拟测序列位置而定，如从起始部测起，当溴酚蓝抵达凝胶的下 三分之一时，即可停止电泳。 4．干胶、曝光 1）干胶 放掉电泳缓冲液，卸下凝胶模具，轻轻撬起短玻璃板，撬时，左手抵住玻璃板对侧， 以防玻璃板滑动，破坏凝胶。翻转玻璃，平置桌上。用略大于胶面的滤纸覆于胶上，轻轻按 平，使胶粘于滤纸之上。捏住胶上滤纸一角，轻轻揭起凝胶，胶面向上，放于干燥器滤纸之 上。开启凝胶干燥器，调至 80℃，揭开盖膜，铺一张相同大小的滤纸于干燥面上（以防真 空干燥时，同位素透过粘于胶上的滤纸，污染干燥器；亦可防止干燥器上已污染的同位素反 过来再污染待干燥的凝胶，影响结果分析）。胶面盖以保鲜膜，开启真空泵，铺平保鲜膜， 以免漏气。盖上盖膜。真空干燥 80-100 分钟。 2）曝光 于暗房内，打开暗盒，置 X 光胶片于增感屏上，将烘干的凝胶胶面朝 X 光片，盖上暗 盒。置暗盒于避光干燥处。曝光 3 天。常规冲片，视显影深浅延长或缩短曝光时间。 5．读片 读片方法同前图示。参照引物之后部分已知序列，读出所测序列，并确认上样次序是 否有误。 实验结果