、电镜与光镜的对比 1.电镜出现的必然性 普通光镜虽然仍是我们观察细胞形态最常用的工具,但由于其所用光源为可见光(或紫外光),故其分辨 率( Resolutionη)存在有一个无法突破的限制。分辨率是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是 用相邻两点间的距离(D)来表示B其公式如下 其中,n为物镜与标本之间介质的折射率;a为镜口角(聚光器交点对物镜镜口的张角) 分辨率的数值越小,显微镜的分辨能力就越大,反之越小。由上述公式可以看出,分辨率的数值与波长成正 比,与镜口率成反比。因此,要想得到高分辨率必须要缩短波长和加大镜口率,在普通光镜中我们使用的光源 为可见光,波长为400~700nm(平均值为550nm),这个数值无法改变,唯一可改变的数值为镜口率 (NA),NA的大小决定于镜口角的大小和物镜与标本间介质折射率( refraction coefficient)的大小。其计 算公式如下: 由此可见,镜口率与n及sina/2成正比。制作镜头所用的光学玻璃的折射率为1.65~1.78,所用介 质的折射率越接近玻璃越理想。空气的折射率为1,水为1.33,香柏油为1.515,α-溴萘为1.66。镜口角 总是小于180°,所以sinα/2的最大值必然小于1。对于干燥物镜来说,介质为空气,镜口率一般为 0.05~0.95;而油镜用香柏油为介质,镜口率可接近1.5,如果用溴萘则可达1.66。而就目前看来,光镜镜口 率的最大值也只有1.78。根据计算,光镜分辨率的最小数值不会小于0.2um(将1.6代入分辨率公式求 得),约等于光波的一半,紫外光显微镜的分辨率也只能达到0.1μm,这一数值是光学分辨率的极限。限制光 镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应),光镜无论制作得如何精密都无法突破这一极限,所以一般光 镜设计的最大放大倍数为1,000~15002,因为将02μm的质点放大到0.2~0.3mm(人肉眼的分辨率)就可 以辨认清楚。 但在一般想象中,似乎显微镜的放大倍数越大,观察到的物体应该越清楚。然而事实并不然,因为在这里 涉及到有效放大和无效放大两个概念。有效放大是指本来用肉眼看不清楚的物体经显微镜放大成像后可以分辨 清楚的放大;而无效放大则是指本来用肉眼能看清楚的物体经放大镜、幻灯机或投影仪等放大成像后可以分辨 得更清楚的放大。此外,我们所看到的物象是否清楚不仅决定于放大倍数,而且还要受到一些物理因素和透镜 质量的影响(例如球差和色差等),但归根到底,影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率。如果 分辨率不再提高,只提高放大倍数毫无意义,并不能增加图像的清晰度。 在光镜下即便是再提高放大倍数也无法看清亚显微结构(或超微结构)。要想看清这些结构,就必须选择 波长更短的光源,以提高显微镜的分辨率。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多(表1),电子束的波长与 发射电子束的电压平方根成反比,也就是说电压越高波长越短。于是,德国柏林大学的 E Rus ka等便选择了 电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限,终于在1938年发明了世界上第一台实用透射电镜。由此可 见,电镜的问世是研究细胞超微结构的必然需要。 2.电镜与光镜的异同点 电镜在结构上与光镜相同,均是由照明光源和透镜构成。所不同的是,(1)电镜所用照明光源为电子枪发 射的高压电子束,而光镜为卤灯(或汞灯)产生的可见光(或紫外光)。(2)电镜所用透镜为电透镜,聚焦方式为 电聚焦;而光镜所用透镜为光学透镜,聚焦方式为机械聚焦。(3)电镜所用介质必须是真空,而光镜则为空气 (详细区别见表2)2 一、电镜与光镜的对比 1. 电镜出现的必然性 普通光镜虽然仍是我们观察细胞形态最常用的工具，但由于其所用光源为可见光(或紫外光)，故其分辨 率(Resolution)存在有一个无法突破的限制。分辨率是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力, 通常是 用相邻两点间的距离(D)来表示 B 其公式如下： 其中，n 为物镜与标本之间介质的折射率；为镜口角（聚光器交点对物镜镜口的张角） 分辨率的数值越小，显微镜的分辨能力就越大，反之越小。由上述公式可以看出，分辨率的数值与波长成正 比，与镜口率成反比。因此, 要想得到高分辨率必须要缩短波长和加大镜口率，在普通光镜中我们使用的光源 为可见光，波长为 400~700nm (平均值为 550nm), 这个数值无法改变, 唯一可改变的数值为镜口率 (N.A.), N.A.的大小决定于镜口角的大小和物镜与标本间介质折射率(refraction coefficient)的大小。其计 算公式如下： 由此可见，镜口率与 n 及 sin /2 成正比。制作镜头所用的光学玻璃的折射率为 1.65~1.78，所用介 质的折射率越接近玻璃越理想。空气的折射率为 1，水为 1.33，香柏油为 1.515，-溴萘为 1.66。镜口角 总是小于 180°, 所以 sin /2 的最大值必然小于 1。对于干燥物镜来说，介质为空气, 镜口率一般为 0.05~0.95; 而油镜用香柏油为介质, 镜口率可接近 1.5, 如果用溴萘则可达 1.66。而就目前看来, 光镜镜口 率的最大值也只有 1.78。根据计算，光镜分辨率的最小数值不会小于 0.2m(将 1.6 代入分辨率公式求 得), 约等于光波的一半，紫外光显微镜的分辨率也只能达到 0.1m , 这一数值是光学分辨率的极限。限制光 镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应), 光镜无论制作得如何精密都无法突破这一极限, 所以一般光 镜设计的最大放大倍数为 1,000~1,500, 因为将 0.2m 的质点放大到 0.2~0.3mm(人肉眼的分辨率)就可 以辨认清楚。 但在一般想象中, 似乎显微镜的放大倍数越大, 观察到的物体应该越清楚。然而事实并不然，因为在这里 涉及到有效放大和无效放大两个概念。有效放大是指本来用肉眼看不清楚的物体经显微镜放大成像后可以分辨 清楚的放大; 而无效放大则是指本来用肉眼能看清楚的物体经放大镜、幻灯机或投影仪等放大成像后可以分辨 得更清楚的放大。此外, 我们所看到的物象是否清楚不仅决定于放大倍数，而且还要受到一些物理因素和透镜 质量的影响(例如球差和色差等), 但归根到底, 影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率。如果 分辨率不再提高，只提高放大倍数毫无意义, 并不能增加图像的清晰度。 在光镜下即便是再提高放大倍数也无法看清亚显微结构(或超微结构)。要想看清这些结构，就必须选择 波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多(表 1), 电子束的波长与 发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。于是，德国柏林大学的 E.Ruska 等便选择了 电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，终于在 1938 年发明了世界上第一台实用透射电镜。由此可 见，电镜的问世是研究细胞超微结构的必然需要。 2. 电镜与光镜的异同点 电镜在结构上与光镜相同，均是由照明光源和透镜构成。所不同的是，(1)电镜所用照明光源为电子枪发 射的高压电子束，而光镜为卤灯(或汞灯)产生的可见光(或紫外光)。(2)电镜所用透镜为电透镜，聚焦方式为 电聚焦; 而光镜所用透镜为光学透镜, 聚焦方式为机械聚焦。(3)电镜所用介质必须是真空，而光镜则为空气 (详细区别见表 2)