3期 谢祖彬等:稻田生物固氮研究进展及方向 543 3稻田生物固氮量影响因素 蒙古、河北、辽宁、山东、陕西、宁夏、广东、 新疆、福建、贵州、四川和黑龙江等13个省市自治 研究表明稻田的淹水环境为光合固氮菌和异养区6个旱地土壤和3个稻田土壤样品中的固氮微生 固氮菌的生物固氮提供了合适的pH和氧化还原状物资源,得到非共生固氮微生物资源181份,其 况等条件。土壤水分状况、水稻品种、施肥和碳有36%属于类芽孢杆菌属,29%属于芽孢杆菌属 源均影响稻田的生物固氮161。土壤有机质高的土11%属于节杆菌属。 Islam Rashedul等2采用无氮培 壤有利于稻田固氮菌生长,有机物的施用促进土壤养分离技术对韩国7种不同施肥管理措施下的稻田 物固氮61。稻草秋季还田的土壤乙炔还原酶活固氮微生物进行了分离,分离到165份细菌,其中 性仅为春季还田的30%;光照条件下纤维素还田土32份具有固氮基因,分别为布克氏菌、鞘氨醇单胞 壤的固氮效率是黑暗条件下的3倍。大量NH抑菌、甲基杆菌、假单胞菌、新鞘氨醇杆菌、杆菌 制固氮酶( nitrogenase)活性,而少量施氮对固氮 类芽孢杆菌、肠杆菌、克雷白氏杆菌、分枝杆菌、 酶活性没有影响920; Charyulu等1报道少量氮肥玫瑰单胞菌、环丝菌、寡养单胞菌、叶杆菌、格里 促进土壤固氮,而大量施用抑制固氮;而且与施肥蒙菌。 da Costa等在巴西3种不同施肥管理土壤上 方式和氮肥种类有关P。wang等2研究了东北黑分离到190份疑似固氮微生物,除了 Islam Rsshedul 土、江苏下位砂姜土、江西红壤和四川紫色士发育等在韩国土壤中发现的布克氏菌、鞘氨醇单胞菌 水稻土的土壤属性与生物固氮量的关系。他们利用假单胞菌、杆菌、类芽孢杆菌、肠杆菌、克雷白氏 Spearman相关技术分析表明生物固氮量与土壤pH, 杆菌、寡养单胞菌等固氮菌外,还有噬氢菌、固氮 交换性Na、Mg,总Ca、总Mg成正相关,与交换 根瘤菌、苍白杄菌、产碱杆菌、根瘤菌、不动杆菌 性A1、活性和无定形A氧化物成负相关。他们进葡萄球菌、泛菌、埃希氏菌、柠檬酸细菌、无色杆 步分析表明土壤pH又与交换性Na、Mg,总Ca 菌、土壤杆菌7。 总Mg成显著正相关,与交换性A、活性和无定 跃固氮微生物指的是发挥固氮作用的固氮微 形A氧化物成显著负相关。但生物固氮量与固氮菌生物。稻田中均有固氮微生物,但稻田中的固氮做 数量(nj/H基因拷贝数)没有关系。进一步在固氮 生物种类和固氮能力各不相同,它们受水稻土类型 菌OTU水平(操作分类单元水平)分析表明生物固性质和管理措施影响。目前有一些关于稻田固氮微 氮量与念珠藻量成显著正相关。他们用随机森林模生物数量和种类的报道,但很少有关于活跃固氮微 生物研究的报道。这与研究活跃固氮微生物难度较 型中的均方差增加百分法评估了土壤各属性对生物 固氮影响的相对重要性,结果表明A氧化物最重 大有关,虽然稳定性同位素核酸探针( DNA Or RNA 要,其他依次为活性Fe、活性A1、总Mg、交换性 stable isotope probing)技术为研究活跃固氮微生物 提供了途径。由于DNA或RNA中C的含量是N的 Mg、CN、有效Cu、土壤有机质、黏粒含量和阳离 两倍多,1C-SP技术从2000年建立28以来已取得 子交换量。 一些进展293,但1N-DNA(RNA)-SP技术进展 缓慢。Ma等用99atom%1N2研究了Mo施用对 4稻田固氮微生物及活跃固氮微生物 稻田土壤活跃固氮微生物的影响,发现非异形蓝细 菌(non- heterocystous cyanobateria)细鞘丝藻属 我国从20世纪70年代末开始从水稻根系分离( leptolyngbya)和微鞘藻属( Microcoleus)是主要 固氮微生物。丘元盛等时分离到2种固氮菌为粪产的活跃固氮微生物。 Buckley等国用98aom%N 碱菌和阴沟肠杆菌。谭志远等从广东和海南普通室内培养土壤的方法研究长期休闲土壤的固氮微生 野生稻中分离到37株内生固氮菌,采用固氮酶m物,但遗憾的是结果中没有提供证据证明1N-DNA 基因PCR扩增测序检测技术,鉴定可能属于克雷伯在密度梯度离心的那一层,也没有提供DNAN丰 氏菌属、泛菌属、克雷伯氏肺炎杆菌、阿氏肠杆菌、度来证明哪些微生物确实发生了固氮作用。大量发 阴沟肠杆菌、丙二酸柠檬酸杆菌、成团泛菌。孙建表的CDNA(RNA)-SIP文章也没有提供DNA 光等采用16SDNA序列分析技术,分析了北京、(RNA)1C丰度292。原因是用稳定性同位素比值 http://pedologica.issas.ac.cn3 期 谢祖彬等：稻田生物固氮研究进展及方向 543 http://pedologica.issas.ac.cn 3 稻田生物固氮量影响因素 研究表明稻田的淹水环境为光合固氮菌和异养 固氮菌的生物固氮提供了合适的 pH 和氧化还原状 况等条件[8]。土壤水分状况、水稻品种、施肥和碳 源均影响稻田的生物固氮[8,16-18]。土壤有机质高的土 壤有利于稻田固氮菌生长，有机物的施用促进土壤 生物固氮[16-18]。稻草秋季还田的土壤乙炔还原酶活 性仅为春季还田的 30%；光照条件下纤维素还田土 壤的固氮效率是黑暗条件下的 3 倍[8]。大量 + NH4 抑 制固氮酶（nitrogenase）活性，而少量施氮对固氮 酶活性没有影响[19-20]；Charyulu 等[18]报道少量氮肥 促进土壤固氮，而大量施用抑制固氮；而且与施肥 方式和氮肥种类有关[21]。Wang 等[22]研究了东北黑 土、江苏下位砂姜土、江西红壤和四川紫色土发育 水稻土的土壤属性与生物固氮量的关系。他们利用 Spearman 相关技术分析表明生物固氮量与土壤 pH， 交换性 Na、Mg，总 Ca、总 Mg 成正相关，与交换 性 Al3+、活性和无定形 Al 氧化物成负相关。他们进 一步分析表明土壤 pH 又与交换性 Na、Mg，总 Ca、 总 Mg 成显著正相关，与交换性 Al3+、活性和无定 形 Al 氧化物成显著负相关。但生物固氮量与固氮菌 数量（nifH 基因拷贝数）没有关系。进一步在固氮 菌 OTU 水平（操作分类单元水平）分析表明生物固 氮量与念珠藻量成显著正相关。他们用随机森林模 型中的均方差增加百分法评估了土壤各属性对生物 固氮影响的相对重要性，结果表明 Al 氧化物最重 要，其他依次为活性 Fe、活性 Al、总 Mg、交换性 Mg、C/N、有效 Cu、土壤有机质、黏粒含量和阳离 子交换量。 4 稻田固氮微生物及活跃固氮微生物 我国从 20 世纪 70 年代末开始从水稻根系分离 固氮微生物。丘元盛等[23]分离到 2 种固氮菌为粪产 碱菌和阴沟肠杆菌。谭志远等[24]从广东和海南普通 野生稻中分离到 37 株内生固氮菌，采用固氮酶 nifH 基因 PCR 扩增测序检测技术，鉴定可能属于克雷伯 氏菌属、泛菌属、克雷伯氏肺炎杆菌、阿氏肠杆菌、 阴沟肠杆菌、丙二酸柠檬酸杆菌、成团泛菌。孙建 光等[25]采用 16S rDNA 序列分析技术，分析了北京、 内蒙古、河北、辽宁、山东、陕西、宁夏、广东、 新疆、福建、贵州、四川和黑龙江等 13 个省市自治 区 67 个旱地土壤和 3 个稻田土壤样品中的固氮微生 物资源，得到非共生固氮微生物资源 181 份，其中 有 36%属于类芽孢杆菌属，29%属于芽孢杆菌属， 11%属于节杆菌属。Islam Rashedul 等[26]采用无氮培 养分离技术对韩国 7 种不同施肥管理措施下的稻田 固氮微生物进行了分离，分离到 165 份细菌，其中 32 份具有固氮基因，分别为布克氏菌、鞘氨醇单胞 菌、甲基杆菌、假单胞菌、新鞘氨醇杆菌、杆菌、 类芽孢杆菌、肠杆菌、克雷白氏杆菌、分枝杆菌、 玫瑰单胞菌、环丝菌、寡养单胞菌、叶杆菌、格里 蒙菌。da Costa 等在巴西 3 种不同施肥管理土壤上 分离到 190 份疑似固氮微生物，除了 Islam Rsshedul 等[26]在韩国土壤中发现的布克氏菌、鞘氨醇单胞菌、 假单胞菌、杆菌、类芽孢杆菌、肠杆菌、克雷白氏 杆菌、寡养单胞菌等固氮菌外，还有噬氢菌、固氮 根瘤菌、苍白杆菌、产碱杆菌、根瘤菌、不动杆菌、 葡萄球菌、泛菌、埃希氏菌、柠檬酸细菌、无色杆 菌、土壤杆菌[27]。 活跃固氮微生物指的是发挥固氮作用的固氮微 生物。稻田中均有固氮微生物，但稻田中的固氮微 生物种类和固氮能力各不相同，它们受水稻土类型、 性质和管理措施影响。目前有一些关于稻田固氮微 生物数量和种类的报道，但很少有关于活跃固氮微 生物研究的报道。这与研究活跃固氮微生物难度较 大有关，虽然稳定性同位素核酸探针（DNA or RNA stable isotope probing）技术为研究活跃固氮微生物 提供了途径。由于 DNA 或 RNA 中 C 的含量是 N 的 两倍多，13C-SIP 技术从 2000 年建立[28]以来已取得 一些进展[29-32]，但 15N-DNA（RNA）-SIP 技术进展 缓慢。Ma 等[33]用 99 atom% 15N2 研究了 Mo 施用对 稻田土壤活跃固氮微生物的影响，发现非异形蓝细 菌（non-heterocystous cyanobateria）细鞘丝藻属 （leptolyngbya）和微鞘藻属（Microcoleus）是主要 的活跃固氮微生物。Buckley 等[34]用 99.8 atom% 15N2 室内培养土壤的方法研究长期休闲土壤的固氮微生 物，但遗憾的是结果中没有提供证据证明 15N-DNA 在密度梯度离心的那一层，也没有提供 DNA15N 丰 度来证明哪些微生物确实发生了固氮作用。大量发 表的 13C-DNA（RNA）-SIP 文章也没有提供 DNA （RNA）13C 丰度[29-32]。原因是用稳定性同位素比值