外联系等,从而实验将提供较大信息量的结果。同时,将质粒和噬菌体DNA作为阴性对照 点于矩阵之侧,以验证杂交的特异性。伴随有一些看家基因的cDNA作为阳性对照以观察 正常mRNA的丰度。以上各基因名称及在 Gen Bank中的编号该公司有专门材料提供 实验首先将1ug的mRNA在含相应同位素和试剂盒提供优化了的引物的反应液中反转 录成cDNA探针。然后用此探针与 CDNA Array尼龙膜上的cDNA杂交,在严格的洗膜后放 射自显影,然后进行分析,比较不同基因或不同膜上同一基因表达的多寡。该公司还有配套 的计算机图象分析软件。 实验结果 在放射自显影的X光片上见有不同深浅的杂交斑点,在斑点矩阵的周围有一些看家基 因的定位杂交点。可以通过试剂盒提供的印有网格的塑料膜确定不同基因表达的变化,或借 助于该公司设计的分析软件对扫描入计算机的图象进行处理 注意事项 1.通常 cDNA Arrays是用来比较两个标本以上的mRNA表达的变化,因此具体操作 时可以同时标记两个或两个以上的探针,每一个探针的标记方法同上。为了减少上样误差 除mRNA外,其余试剂可以先统一配置,混匀,然后分别加入不同来源的mRNA中进行探 针的标记 2.我们曾作过比较,采用总RNA不理想,mRNA浓度不够,背景高。采用mRNA 的效果比较理想,因此我们推荐采用mRNA标记探针。mRNA的分离方法请参见本书有关 章节的论述。 3.常用的同位素有[a-32P]dATP和[u-3P]dAIP,我们使用下来,[u-32P]dAP效果比较 好,曝光时间短,变化明显,灵敏度高。对于那些强反应的部位,可以方便地调整曝光时间, 取得最佳效果。[a-3P]dATP则要求较长的曝光时间,对比反而不够灵敏。 4.当鲑精DNA浓度很高时,一旦冷却,不易溶解,因此可以变性后,趁热直接加入 已加热的 ExpressHyb,并混匀 5.探针的变性是必须的。常见的问题是标记完探针,分离去未标记的同位素后,忘记将探 针变性,引起实验失败 四、中医药对广泛基因差异转录(mRNA)作用的研究 实验12 DDPCR 实验目的:同时观察大量未知基因转录变化 中医药治疗疾病通过改变和调整哪些基因的转录,不同产地的天然中药其有效成分表 达的不同是由于那些基因表达差异所造成的,中医证的变化主要有那些基因变化的基础,等 等。这类问题摆在中医科学工作者面前,要求解决。但是,茫茫基因,从而着手?以往的研 究主要观察一至若干个已知与某病相关的基因与疾病或证的关系,但由于基因不是单独存在 的,其表达调控有赖于其他许多基因产物的调节,反过来,其产物也会对其他基因产生调节 和影响。那么复杂的生命现象通过观察若干个基因往往是难以满足研究的要求的。而 DDPCR 技术的产生,提供了便捷的工具 原理 DDPCR技术利用了PCR技术,实验首先提取欲观察不同细胞或组织的总RNA,然后 分别加入三个锚引物,H-T1-C、H-Ti1G和HT1-A,使三个引物的11个T(胸苷)选择性 地结合到mRNA的A(腺苷)尾上,在反转录酶的作用下,将所有的mRNA反转录成cDNA 再以这一含cDNA的反应液为模板,分别加入以上三个锚引物,和若干随机引物,如 AAGCTTGATTGCO, AAGCTTCGACTGT等,PCR放大位于某一特定错引物与随机引物相 应序列的所有cDNA,反应体中加入3P]dATP或q3 S]dATP。将两个或两个以上细胞系或 组织的锚引物与随机引物相一致的PCR产物相邻上样于变性测序凝胶上,电泳,使不同大 小的PCR片段得到分离,然后放射自显影,曝光。如果两个或两个以上细胞系或组织mRNA 相同,在相邻泳道对应的胶片上可以见到并列的显影条带,如果转录的量不同,则两条片段 的深浅阔窄会有不同:如果某一基因仅仅在某一组织独特的表达,则会在对应于该组织的泳 道上出现显影条带,而相邻的组织泳道上则空白。以后,可以分离这些独特表达的基因,做 进一步的 northern blot鉴定,基因克隆重组,鉴定,测序,并与 GenBank比较,以明确差外联系等，从而实验将提供较大信息量的结果。同时，将质粒和噬菌体 DNA 作为阴性对照 点于矩阵之侧，以验证杂交的特异性。伴随有一些看家基因的 cDNA 作为阳性对照以观察 正常 mRNA 的丰度。以上各基因名称及在 GenBank 中的编号该公司有专门材料提供。 实验首先将1ug的mRNA在含相应同位素和试剂盒提供优化了的引物的反应液中反转 录成 cDNA 探针。然后用此探针与 cDNA Array 尼龙膜上的 cDNA 杂交，在严格的洗膜后放 射自显影，然后进行分析，比较不同基因或不同膜上同一基因表达的多寡。该公司还有配套 的计算机图象分析软件。 实验结果 在放射自显影的 X 光片上见有不同深浅的杂交斑点，在斑点矩阵的周围有一些看家基 因的定位杂交点。可以通过试剂盒提供的印有网格的塑料膜确定不同基因表达的变化，或借 助于该公司设计的分析软件对扫描入计算机的图象进行处理。 注意事项 1．通常 cDNA Arrays 是用来比较两个标本以上的 mRNA 表达的变化，因此具体操作 时可以同时标记两个或两个以上的探针，每一个探针的标记方法同上。为了减少上样误差， 除 mRNA 外，其余试剂可以先统一配置，混匀，然后分别加入不同来源的 mRNA 中进行探 针的标记。 2．我们曾作过比较，采用总 RNA 不理想，mRNA 浓度不够，背景高。采用 mRNA 的效果比较理想，因此我们推荐采用 mRNA 标记探针。mRNA 的分离方法请参见本书有关 章节的论述。 3．常用的同位素有[α- 32P]dATP 和[α- 33P]dATP，我们使用下来，[α- 32P]dATP 效果比较 好，曝光时间短，变化明显，灵敏度高。对于那些强反应的部位，可以方便地调整曝光时间， 取得最佳效果。[α- 33P]dATP 则要求较长的曝光时间，对比反而不够灵敏。 4．当鲑精 DNA 浓度很高时，一旦冷却，不易溶解，因此可以变性后，趁热直接加入 已加热的 ExpressHyb，并混匀。 5．探针的变性是必须的。常见的问题是标记完探针，分离去未标记的同位素后，忘记将探 针变性，引起实验失败。 四、中医药对广泛基因差异转录（mRNA）作用的研究 实验 12 DDPCR 实验目的：同时观察大量未知基因转录变化。 中医药治疗疾病通过改变和调整哪些基因的转录，不同产地的天然中药其有效成分表 达的不同是由于那些基因表达差异所造成的，中医证的变化主要有那些基因变化的基础，等 等。这类问题摆在中医科学工作者面前，要求解决。但是，茫茫基因，从而着手？以往的研 究主要观察一至若干个已知与某病相关的基因与疾病或证的关系，但由于基因不是单独存在 的，其表达调控有赖于其他许多基因产物的调节，反过来，其产物也会对其他基因产生调节 和影响。那么复杂的生命现象通过观察若干个基因往往是难以满足研究的要求的。而 DDPCR 技术的产生，提供了便捷的工具。 原理 DDPCR 技术利用了 PCR 技术，实验首先提取欲观察不同细胞或组织的总 RNA，然后 分别加入三个锚引物，H-T11-C、H-T11-G 和 H-T11-A，使三个引物的 11 个 T（胸苷）选择性 地结合到 mRNA 的 A（腺苷）尾上，在反转录酶的作用下，将所有的 mRNA 反转录成 cDNA。 再以这一含 cDNA 的反应液为模板，分别加入以上三个锚引物，和若干随机引物，如 AAGCTTGATTGCC，AAGCTTCGACTGT 等，PCR 放大位于某一特定锚引物与随机引物相 应序列的所有 cDNA，反应体中加入 α[33P]dATP 或 α[35S]dATP。将两个或两个以上细胞系或 组织的锚引物与随机引物相一致的 PCR 产物相邻上样于变性测序凝胶上，电泳，使不同大 小的 PCR 片段得到分离，然后放射自显影，曝光。如果两个或两个以上细胞系或组织 mRNA 相同，在相邻泳道对应的胶片上可以见到并列的显影条带，如果转录的量不同，则两条片段 的深浅阔窄会有不同；如果某一基因仅仅在某一组织独特的表达，则会在对应于该组织的泳 道上出现显影条带，而相邻的组织泳道上则空白。以后，可以分离这些独特表达的基因，做 进一步的 Northern blot 鉴定，基因克隆重组，鉴定，测序，并与 GenBank 比较，以明确差