作控制单元 3.真空系统 (1)机械泵(2)扩散泵 扫描电镜的使用操作 1.开机:抽真空30分钟 2.装入或更换样品 3.观察条件的选择 4.图像的选择与调整 关机 超显微结构制样技术 电子束的穿透能力较弱生物样品厚度10~100nm 制备程序:取材、固定、漂洗、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色 程序:取材 1.取材的要求:尽可能保持生物体生活状态的结构。取材操作必须做到以下几点: (1)低温:0~4℃,所用固定液及容器应预先冷却。 (2)防损伤:取材器械要锋利,动作要轻巧 (3)准:电镜视野很小,选择部位要准确取材 (4)快:切取组织时速度要快,1分钟之内浸入固定液。 (5)小:进入固定液的样品块要小,一般不超过mm3或截面为1m2的小长条。 取材的方法 (1)动物材料:将动物迅速杀死并解剖,取出所需组织器官,用锋利的刀片切取一小块组织,立即 放在滴有冷固定液的塑料板上细切,切成1mm3的小块,放入盛有冷固定液的小瓶中固定。 (2)植物材料:尽快放入固定液中,使样品沉到固定液的底部。一般植物叶片常切成1m宽,2~3mm 长的小条,茎和根可根据需要切成小条或lm3的小块。表面有蜡质的叶片在50%乙醇溶液中泡 几秒至几十秒进行脱蜡,取出后用双蒸水清洗数次,再进行切取 取材的方法 (3)体外培养细胞:先倒出培养液,加入适量的戊二醛固定液,冰浴3~5分钟,用橡皮刮子轻轻 刮下贴璧的细胞,将含有细胞的固定液移入离心管中,2000r/min低速离心15~20分钟,使细 胞聚成团块,弃去上清液,加入新鲜固定液。 (4)不易形成团块的材料:液体培养细胞、血液等离心后细胞不易形成团块的材料,先离心形成松 散的小团块,然后轻轻地悬浮在固定液中,固定后再离心成松散的小团块。弃去固定液,用热吸管 吸一滴已加热溶化并冷却到500C的2%琼脂加到细胞团中使细胞悬浮,进行预包埋,再用吸管取 出放于载玻片上铺成薄层,固化后切成1mm3小块。 固定 固定:用化学法或物理法迅速杀死细胞的过程。化学固定法较为常用。 目的:使细胞中各种细胞器及大分子尽可能真实地保持生活状态的结构,并牢固地固定在它原来 的位置上,而且不会因一系列后继的处理使其移位或丢失。 固定剂 化学固定剂可分为两大类 凝固固定剂:丙酮、乙醇,醋酸、苦味酸等,它们使蛋白质发生凝聚沉淀。破坏了蛋白质的分子结 构,仅适用于光镜样品的固定。 非凝固固定剂:四氧化锇、醛类、高锰酸钾、重铬酸钾等,它们和蛋白质化学结合并形成分子间的 交联,能较好保存蛋白质的分子结构。适用于电镜样品的固定。 理想的固定剂 (1)能迅速而又均匀地渗入组织细胞内,并能尽快地杀死细胞以减少细胞自溶。 (②)能稳定细胞物质成分,如核蛋白、核酸、糖类等使之发生交联,减少或避免在脱水、渗透及包 埋过程中的抽提作用。 (3)能避免细胞结构膨胀或收缩,不产生人工假像或变形,保证获得真实的电镜图像. (4)能提供一定的电子反差。 几种常用固定剂 1)四氯化锇:(锇酸)其水溶液在室温下易挥发,极毒,极易还原变黑,配制和使用时需要在强通风作控制单元 3．真空系统: (1)机械泵 (2)扩散泵 扫描电镜的使用操作 1． 开机：抽真空 30 分钟 2．装入或更换样品 3．观察条件的选择 4．图像的选择与调整 5 ．关机 超显微结构制样技术 电子束的穿透能力较弱 生物样品厚度 l0 ～100nm 制备程序 :取材、固定、漂洗、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色 程序 ：取材 1．取材的要求 ：尽可能保持生物体生活状态的结构。取材操作必须做到以下几点 ： (1 )低温：0 ～4℃，所用固定液及容器 应预先冷却。 (2)防损伤 ：取材器械要锋利，动作要轻巧。 (3)准：电镜视野很小，选择部位要准确取材 (4)快 ：切取组织时速度要快 ， 1 分钟之内浸入固定液。 (5)小：进入固定液的样品块要小，一般不超过 mm３或截面为 1mm２的小长条。 取材的方法 (1)动物材料 ：将动物迅速杀死并解剖，取出所需组织器官，用锋利的刀片切取一小块组织，立即 放在滴有冷固定液的塑料板上细切，切成 lmm3 的小块，放入盛有冷固定液的小瓶中固定。 (2)植物材料：尽快放入固定液中，使样品沉到固定液的底部。一般植物叶片常切成 1mm 宽，2～3mm 长的小条，茎和根可根据需要切成小条或 lmm3 的小块。表面有蜡质的叶片在 50％乙醇溶液中 泡 几秒至几十秒进行脱蜡，取出后用双蒸水清洗数次，再进行切取。 取材的方法 (3)体外培养细胞 ：先倒出培养液，加入适量的戊二醛固定液，冰浴 3～5 分钟，用橡皮刮子轻轻 刮下贴璧的细胞，将含有细胞的固定液移入离心管中， 2000r ／min 低速离心 15～20 分钟，使细 胞聚成团块，弃去上清液，加入新鲜固定液。 (4)不易形成团块的材料：液体培养细胞、血液等离心后细胞不易形成团块的材料，先离心形成松 散的小团块，然后轻轻地悬浮在固定液中，固定后再离心成松散的小团块。弃去固定液，用热吸管 吸一滴已加热溶化并冷却到 500C 的 2％琼脂加到细胞团中使细胞悬浮，进行预包埋，再用吸管取 出放于载玻片上铺成薄层，固化后切成 lmm3 小块 。 固定 固定：用化学法或物理法迅速杀死细胞的过程。化学固定法较为常用。 目的 ：使细胞中各种细胞器及大分子尽可能真实地保持生活状态的结构，并牢固地固定在它原来 的位置上，而且不会因一系列后继的处理使其移位或丢失 。 固定剂 化学固定剂可分为两大类： 凝固固定剂：丙酮、乙醇，醋酸、苦味酸等，它们使蛋白质发生凝聚沉淀。破坏了蛋白质的分子结 构，仅适用于光镜样品的固定。 非凝固固定剂：四氧化锇、醛类、高锰酸钾、重铬酸钾等，它们和蛋白质化学结合并形成分子间的 交联，能较好保存蛋白质的分子结构。适用于电镜样品的固定。 理想的固定剂 (1)能迅速而又均匀地渗入组织细胞内，并能尽快地杀死细胞以减少细胞自溶。 (2)能稳定细胞物质成分，如核蛋白、核酸、糖类等使之发生交联，减少或避免在脱水、渗透及包 埋过程中的抽提作用。 (3)能避免细胞结构膨胀或收缩，不产生人工假像或变形，保 证获得真实的电镜图像． (4)能提供一定的电子反差。 几种常用固定剂 1)四氯化锇：(锇酸)其水溶液在室温下易挥发，极毒，极易还原变黑，配制和使用时需要在强通风