2.准备二组各12支试管,第一组12支试管每支都加入0.2m上表中相应的缓冲液, 然后加入一定量的蔗糖酶(此时的蔗糖酶只能用H2O稀释,酶的稀释倍数和加入量要选 择适当,以便在当时的实验条件下能得到0.6~10的光吸收值(A60)。另一组12支试 管也是每支都加入0.2m上表中相应的缓冲液,但不再加酶而加入等量的去离子水,分 别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到0.8ml。 3.所有的试管按一定时间间隔加入02m蔗糖(0.molL开始反应,反应10min后分 别加入l.0ml碱性铜试剂,用保鲜膜包住试管口并剌一小孔,在沸水浴中煮8分钟,取 出速冷,分别加入1.0ml磷钼酸试剂,反应完毕后加入5.0ml水,摇匀测定A650 4.本实验再准备二支试管,一支用水作空白对照:另一支作葡萄糖标准管。 5.画出不同pH下蔗糖酶活性(μ moles/min)与pH的关系曲线,注意画出pH值相同 而离子不同的两点,观察不同离子对酶活性的影响 (六)温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。温度对酶的作用具有双重影响,一方面温 度升高会加速酶反应速度:另一方面又会加速酶蛋白的变性速度,因此,在较低的温度 范围内,酶反应速度随温度升高而增大,但是超过一定温度后,反应速度反而下降。酶 反应速度达到最大时的温度称为酶反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定,在 系列不同的温度下测定酶活力,即可得到温度~酶活性曲线,并得到酶反应的最适温度 最适温度不是一个恒定的数值,它与反应条件有关。例如反应时间延长,最适温度将降 低。大多数酶在60℃以上变性失活,个别的酶可以耐100℃左右的高温。本实验除了测 定蔗糖酶催化蔗糖水解反应的热稳定温度范围与最适温度外,还可以同时测定反应的活 化能。活化能越低,反应速度就越快。酶作为催化剂可以大大降低反应的活化能,从而 大大增加反应的速度。本实验除了测定蔗糖酶催化反应的活化能外,还要测定酸催化这 一反应的活化能,后者比前者要大的多,说明酸催化的能力远不及蔗糖酶。 活化能可用阿累尼乌斯方程式计算: In k ea R T 式中:Ea为话化能(Ca/mole),k为反应速度常数( umoles/min),R为气体常数 (1.987Cal/deg·mole),T为绝对温度(℃C+273),A为常数。 本实验中的速度常数“k”,可以直接用所测定的吸光度值或反应速度v代替,进行 作图和计算,请对此进行推导和论证(提示:蔗糖酶催化蔗糖底物水解的反应是一级反 应) 实验方法: 本实验要测定0℃~100℃,之间16个不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度 233233 2. 准备二组各 12 支试管，第一组 12 支试管每支都加入 0.2ml 上表中相应的缓冲液， 然后加入一定量的蔗糖酶（此时的蔗糖酶只能用 H2O 稀释，酶的稀释倍数和加入量要选 择适当，以便在当时的实验条件下能得到 0.6~1.0 的光吸收值（A650））。另一组 12 支试 管也是每支都加入 0.2ml 上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分 别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到 0.8ml。 3. 所有的试管按一定时间间隔加入 0.2ml 蔗糖（0.2mol/L)开始反应，反应 10min 后分 别加入 1.0ml 碱性铜试剂，用保鲜膜包住试管口并剌一小孔，在沸水浴中煮 8 分钟，取 出速冷，分别加入 1.0ml 磷钼酸试剂，反应完毕后加入 5.0ml 水，摇匀测定 A650。 4. 本实验再准备二支试管，一支用水作空白对照；另一支作葡萄糖标准管。 5. 画出不同 pH 下蔗糖酶活性（moles/min）与 pH 的关系曲线，注意画出 pH 值相同， 而离子不同的两点，观察不同离子对酶活性的影响。 （六）温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。温度对酶的作用具有双重影响，一方面温 度升高会加速酶反应速度；另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，因此，在较低的温度 范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶 反应速度达到最大时的温度称为酶反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，在一 系列不同的温度下测定酶活力，即可得到温度～酶活性曲线，并得到酶反应的最适温度。 最适温度不是一个恒定的数值，它与反应条件有关。例如反应时间延长，最适温度将降 低。大多数酶在 60℃以上变性失活，个别的酶可以耐 100℃左右的高温。本实验除了测 定蔗糖酶催化蔗糖水解反应的热稳定温度范围与最适温度外，还可以同时测定反应的活 化能。活化能越低，反应速度就越快。酶作为催化剂可以大大降低反应的活化能，从而 大大增加反应的速度。本实验除了测定蔗糖酶催化反应的活化能外，还要测定酸催化这 一反应的活化能，后者比前者要大的多，说明酸催化的能力远不及蔗糖酶。 活化能可用阿累尼乌斯方程式计算： 式中： Ea为话化能（Cal/mole），k 为反应速度常数（moles/min），R 为气体常数 （1.987Cal/deg﹒mole），T 为绝对温度（℃+273），A 为常数。 本实验中的速度常数“k”，可以直接用所测定的吸光度值或反应速度 v 代替，进行 作图和计算，请对此进行推导和论证（提示：蔗糖酶催化蔗糖底物水解的反应是一级反 应）。 实验方法： 本实验要测定 0℃～100℃，之间 16 个不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。 A R T E k a = −  + 1 ln