第10期 曹艳秋等：大孔吸附树脂从藻粉中分离纯化微囊藻毒素 ·1257· 碍，因此迫切需要建立一种低成本、大规模提取纯 匀粉末 化MCLR的方法.目前国内外对微囊藻毒素进行 天然藻粉]→超声萃取→离心 提纯和制备的方法有吸附法4、萃取法同、膜分离 法间、色谱法)等，较为常用的是制备色谱法8-： 但该方法在技术上存在一定的缺陷，处理样品量少 微囊藻毒素初级粗品←一冷冻干燥 而且成本高.针对上述问题，本文采用易于操作 和放大规模的固相吸附法[对藻毒素的纯化进行 图1从天然藻粉中制备微囊藻毒素初级粗品方法 了研究，即采用大孔树脂吸附天然藻粉中的微囊藻 Fig.1 Preparation method of MC-LR crude powder from 毒素，通过淋洗去除吸附在树脂上的杂质，再把微 natural algae powder 囊藻毒素从树脂上洗脱下来获得较高纯度的微囊藻 1.3.2初级粗品粉末均匀性检验 毒素溶液，从而实现提纯目的，为大规模制备微囊 将制备好的藻粉初级粗品按四分法取点，均匀 藻毒素标准品提供研究基础.固相吸附法是水中微 取16点，每点取量约0.1g,用50mL体积分数 量或痕量微囊藻毒素检测的前处理方法之一，但在 60%的甲醇溶液复溶，采用高效液相色谱检测其中 制备和提纯微囊藻毒素的研究中报道不多.王中婵 微囊藻毒素含量 等4曾就D1300、D101、YRP.Ⅱ、CAD-45、NKA 1.3.3洗脱剂浓度的选择及用量的确定 和AB-8五种大孔树脂对微囊藻毒素的分离情况进 由于甲醇水溶液对微囊藻毒素具有良好溶解 行了研究，表明D101树脂的分离效果最好。本文 性，因此选定甲醇水溶液进行洗脱，但是不同体 通过比较D101树脂和XAD2树脂的分离效果，进 积分数的甲醇水溶液的溶解能力不同，因此需要进 一步提高了分离产物的纯度，并对分离过程进行了 行最佳甲醇体积分数的选择.本文比较了体积分数 细化研究 30%、50%、60%、70%和90%的甲醇水溶液对天然藻 1 实验材料和方法 粉中微囊藻毒素MC-LR的提取效果，将提取液中 1.1实验仪器 微囊藻毒素MC-LR质量浓度最大的那组甲醇水溶 液中甲醇的体积分数定为最佳洗脱剂体积分数 SHIMADZU岛津高效液相色谱仪（紫外-可见 为了确定洗脱液的用量，取一定量微囊藻毒素 检测器配LC solution Lite工作站)，Inerteil ODS-3 初级粉末复溶后吸附到树脂柱上，采用最佳体积分 色谱柱(416mm×250mm,5m),RE52CS旋转蒸 数的甲醇水溶液进行洗脱，用10mL量筒收集流出 发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-250B超声波清洗 的洗脱液，每流出10mL作为一个样品，编号为1， 器，MILLIPORE超纯水机（美国），高速冷冻离心 2,·,13,共13份10mL样品，再把各个样品浓 机(1-15K,Sigma公司)，0.45m的混合纤维素酯 缩至1L,然后用HPLC检测浓缩后样品中微囊 微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司），四氟乙烯 藻毒素MC-LR的质量浓度.将微囊藻毒素MC-LR 塞50mL滴定管 质量浓度对洗脱液体积作图，得到MC-LR的淋洗 1.2实验试剂 曲线，从而确定洗脱剂的用量 天然藻粉（取自北京市郊区），MC-L标准品 1.3.4大孔树脂纯化方法建立 (Alexis公司)，甲醇（分析纯，北京化学试剂公司）， 取5g树脂湿法装柱，微囊藻毒素初级粗品复 乙酸（分析纯，北京化学试剂公司），丙酮（分析 溶后吸附于树脂，比较分别使用不同用量的乙酸乙 纯，北京化学试剂公司)，三氟乙酸（化学纯，北 酯（由于乙酸乙酯与水混溶比例较低，所以直接使 京化学试剂公司)，XAD-2树脂(SIGMA AMBER- 用乙酸乙酯)淋洗，高效液相色谱实时监测淋洗液 LTE),D101树脂（天津市光复精细化工研究所）. 中微囊藻毒素MC-LR,检测到微囊藻毒素MC-LR 1.3实验方法 色谱峰出现时停止淋洗，记录乙酸乙酯最大用量， 1.3.1微囊藻毒素初级粗品的制备 并用体积分数为60%的甲醇溶液洗脱树脂上的微囊 将一定量天然藻粉置于体积分数60%的甲醇溶 藻毒素，将溶有微囊藻毒素的甲醇溶液旋转蒸发浓 液中超声萃取18mim,然后离心分离，获得的上清 缩至20L,采用高效液相色谱法测定微囊藻毒素 液经真空冷冻干燥12h后，置于70℃恒温烘干24 MCLR的质量浓度，计算获得产品中微囊藻毒素 h,得到微囊藻毒素初级粗品.制备过程如图1所 MCLR质量占原始粗品中微囊藻毒素MC-LR质 示。然后将初级粗品粉碎至100目得到初级粗品均 量之比（回收率），同时通过微囊藻毒素粗品和经过第 10 期 曹艳秋等：大孔吸附树脂从藻粉中分离纯化微囊藻毒素 1257 ·· 碍，因此迫切需要建立一种低成本、大规模提取纯 化 MC-LR 的方法. 目前国内外对微囊藻毒素进行 提纯和制备的方法有吸附法 [4]、萃取法 [5]、膜分离 法 [6]、色谱法 [7] 等，较为常用的是制备色谱法 [8−9]； 但该方法在技术上存在一定的缺陷，处理样品量少 而且成本高. 针对上述问题，本文采用易于操作 和放大规模的固相吸附法 [10] 对藻毒素的纯化进行 了研究，即采用大孔树脂吸附天然藻粉中的微囊藻 毒素，通过淋洗去除吸附在树脂上的杂质，再把微 囊藻毒素从树脂上洗脱下来获得较高纯度的微囊藻 毒素溶液，从而实现提纯目的，为大规模制备微囊 藻毒素标准品提供研究基础. 固相吸附法是水中微 量或痕量微囊藻毒素检测的前处理方法之一，但在 制备和提纯微囊藻毒素的研究中报道不多. 王中婵 等 [4] 曾就 D1300、D101、YRP- Ⅱ、CAD-45、NKA 和 AB-8 五种大孔树脂对微囊藻毒素的分离情况进 行了研究，表明 D101 树脂的分离效果最好。本文 通过比较 D101 树脂和 XAD2 树脂的分离效果，进 一步提高了分离产物的纯度，并对分离过程进行了 细化研究. 1 实验材料和方法 1.1 实验仪器 SHIMADZU 岛津高效液相色谱仪 (紫外 - 可见 检测器配 LC solution Lite 工作站)，Inerteil ODS-3 色谱柱 (416 mm×250 mm, 5 µm)，RE52CS 旋转蒸 发仪 (上海亚荣生化仪器厂)，KQ-250B 超声波清洗 器，MILLIPORE 超纯水机 (美国)，高速冷冻离心 机 (1-15 K，Sigma 公司)，0.45 µm 的混合纤维素酯 微孔滤膜 (天津津腾实验设备有限公司)，四氟乙烯 塞 50 mL 滴定管. 1.2 实验试剂 天然藻粉 (取自北京市郊区)，MC-LR 标准品 (Alexis 公司)，甲醇 (分析纯，北京化学试剂公司)， 乙酸 (分析纯， 北京化学试剂公司)， 丙酮 (分析 纯，北京化学试剂公司)，三氟乙酸 (化学纯，北 京化学试剂公司)，XAD-2 树脂 (SIGMA AMBER￾LITE)，D101 树脂 (天津市光复精细化工研究所). 1.3 实验方法 1.3.1 微囊藻毒素初级粗品的制备 将一定量天然藻粉置于体积分数 60%的甲醇溶 液中超声萃取 18 min，然后离心分离，获得的上清 液经真空冷冻干燥 12 h 后，置于 70 ℃恒温烘干 24 h，得到微囊藻毒素初级粗品. 制备过程如图 1 所 示。然后将初级粗品粉碎至 100 目得到初级粗品均 匀粉末. 图 1 从天然藻粉中制备微囊藻毒素初级粗品方法 Fig.1 Preparation method of MC-LR crude powder from natural algae powder 1.3.2 初级粗品粉末均匀性检验 将制备好的藻粉初级粗品按四分法取点，均匀 取 16 点，每点取量约 0.1 g，用 50 mL 体积分数 60%的甲醇溶液复溶，采用高效液相色谱检测其中 微囊藻毒素含量. 1.3.3 洗脱剂浓度的选择及用量的确定 由于甲醇水溶液对微囊藻毒素具有良好溶解 性，因此选定甲醇水溶液进行洗脱，但是不同体 积分数的甲醇水溶液的溶解能力不同，因此需要进 行最佳甲醇体积分数的选择. 本文比较了体积分数 30%、50%、60%、70%和 90%的甲醇水溶液对天然藻 粉中微囊藻毒素 MC-LR 的提取效果，将提取液中 微囊藻毒素 MC-LR 质量浓度最大的那组甲醇水溶 液中甲醇的体积分数定为最佳洗脱剂体积分数. 为了确定洗脱液的用量，取一定量微囊藻毒素 初级粉末复溶后吸附到树脂柱上，采用最佳体积分 数的甲醇水溶液进行洗脱，用 10 mL 量筒收集流出 的洗脱液，每流出 10 mL 作为一个样品，编号为 1, 2, · · · , 13，共 13 份 10 mL 样品，再把各个样品浓 缩至 1 mL，然后用 HPLC 检测浓缩后样品中微囊 藻毒素 MC-LR 的质量浓度. 将微囊藻毒素 MC-LR 质量浓度对洗脱液体积作图，得到 MC-LR 的淋洗 曲线，从而确定洗脱剂的用量. 1.3.4 大孔树脂纯化方法建立 取 5 g 树脂湿法装柱，微囊藻毒素初级粗品复 溶后吸附于树脂，比较分别使用不同用量的乙酸乙 酯 (由于乙酸乙酯与水混溶比例较低，所以直接使 用乙酸乙酯) 淋洗，高效液相色谱实时监测淋洗液 中微囊藻毒素 MC-LR，检测到微囊藻毒素 MC-LR 色谱峰出现时停止淋洗，记录乙酸乙酯最大用量， 并用体积分数为 60%的甲醇溶液洗脱树脂上的微囊 藻毒素，将溶有微囊藻毒素的甲醇溶液旋转蒸发浓 缩至 20 mL，采用高效液相色谱法测定微囊藻毒素 MC-LR 的质量浓度，计算获得产品中微囊藻毒素 MC-LR 质量占原始粗品中微囊藻毒素 MC-LR 质 量之比 (回收率)，同时通过微囊藻毒素粗品和经过