第三章酶通论 位;反之,底物存在下,该基团可被同一试剂修饰,且使酶失活,在则该 基团不是活性部位的基团,而是结构基团。 根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团,化学修饰可分 为 (1)、非特异性共价共接修饰:修饰试剂既可与酶的活性部位的某特 异基团结合,又可与酶的非活性部位的同一基团结合,称之为非特异性共 价共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位,在非活性部位不存在或 极少存在。判断标准是一:酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比;二 底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。 (2)、特异性的共价修饰:修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特 定基团,使酶失活。如:DIFP(二异丙基氟磷酸)可专一性地结合丝氨酸 蛋白酶活性部位的丝氨酸一OH而使酶失活。DIFP一般不与蛋白质反应, 也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应,只与活性的酶且活性部位含 丝氨酸的酶结合。 3亲和标记法: 根据酶与底物能特异性的结合的性质,设计合成一种含反应基团的底 物类似物,作为活性部位的标记试剂,它能象底物一样进入酶的活性部位, 并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合,使酶失 去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为:N一对甲苯磺酰一L一苯丙氨酰乙酯 或甲酯,根据此结构设计的亲和标记试剂为:N一对甲苯磺酰一苯丙氨酰氯 甲基酮(TPCK)。 4X一射线衍射法:把一纯酶的ⅹ一射线晶体衍射图谱与酶与底物反应 后的Ⅹ-射线图谱相比较,即可确定酶的活性中心。 5基因定位突变法 如果用同位素标记酶的活性中心后,将酶水解,分离带标记水解片段, 对其进行一级结构测定,就可了解酶的活性中心的一级结构。对各种蛋白 水解酶进行类似的分析,功能类似的酶在一级结构上有惊人的相似性 活性部位的一般特点 ①只占酶整个体积的相当小的一部分;②是一个三维实体(立体空间) ③多是裂隙、裂缝或凹穴;④多数底物与酶结合时通过弱的作用力;⑤结第三章 酶通论 7 位；反之，底物存在下，该基团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该 基团不是活性部位的基团，而是结构基团。 根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分 为： （1）、非特异性共价共接修饰：修饰试剂既可与酶的活性部位的某特 异基团结合，又可与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共 价共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非活性部位不存在或 极少存在。判断标准是一：酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；二： 底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。 （2）、特异性的共价修饰：修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特 定基团，使酶失活。如：DIFP（二异丙基氟磷酸）可专一性地结合丝氨酸 蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH 而使酶失活。DIFP 一般不与蛋白质反应， 也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应，只与活性的酶且活性部位含 丝氨酸的酶结合。 3.亲和标记法： 根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底 物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位， 并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失 去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为：N—对甲苯磺酰—L—苯丙氨酰乙酯 或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N—对甲苯磺酰—苯丙氨酰氯 甲基酮（TPCK）。 4.X－射线衍射法：把一纯酶的 X—射线晶体衍射图谱与酶与底物反应 后的 X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。 5.基因定位突变法 如果用同位素标记酶的活性中心后，将酶水解，分离带标记水解片段， 对其进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一级结构。对各种蛋白 水解酶进行类似的分析，功能类似的酶在一级结构上有惊人的相似性。 活性部位的一般特点： ①只占酶整个体积的相当小的一部分；②是一个三维实体（立体空间）； ③多是裂隙、裂缝或凹穴；④多数底物与酶结合时通过弱的作用力；⑤结