史晶洁,等.人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展 255 所以 HPV VLP长期储存须浓缩至高浓度。 已知HPⅤVLP具有较强的表面活性且部分疏 L6L2蛋白 水表面暴露。在外界人为地涡流、搅拌、震荡、抽吸 作为同为晚期蛋白的次要衣壳蛋白L2,其在组等操作过程中会使得空气与溶液表面充分接触,使 装中作用的研究也未被忽略。众多研究中都提及到得VLP和外界组分的相互作用增强。进而蛋白质 HPVL1可以在没有L2的参与下自组装为VLP。变性或VLP解离 但在真实的感染过程中,L2在包裹病毒基因进入病2小结与展望 原体过程中起到了关键性作用。在1992年,Kirm 目前, HPV VLP除了本身作为疫苗外,还广泛 bauer r等人3提出了L2能够协助L1完成VLP应用在嵌合VLP疫苗以及作为VLP载体35 结构组装的猜测。第二年,他就证明了自己的假设。方面VLP能够接受外源片段的插入并融合表达,可 作者利用杆状病毒双表达系统共转染HPV16、将抗原的重要表位在VLP表面进行展示。 Kanda CRPV、BPVL1/L2,发现相比在仅有L1参与的情T等人构建了HPV16L1/L2共表达的嵌合 况下,L1/L2ⅥLP产量提高了近4倍。2005年VLP,发现免疫的家兔血清中的抗体能够中和 Ishii y等人对HPV16VLP组装过程中L2的HPV18、HPV31、HPV52、HPV58假病毒。另一方 作用进行了详细的研究。研究表明L2本身不与L1面,有研究表明VLP能够作为呈递质粒DNA或者 组装后完整的衣壳体连接,它可与L1的衣壳粒即蛋白质表位的载体。 五聚体结合形成复合物,并且L2可以在没有二硫 1992年首次发现BPV-1及HPV16可通过杆 键参与的基础上辅助五聚体构成类似“小ⅤLP”的状病毒载体在昆虫细胞中表达L1蛋白并自组装为 结构。L2能促使本不能形成VLP的L1突变蛋白VLP。以此为起点,HPⅤVLP组装各方面的研究 (如HPV16的C175S或C428S)形成VLP。但拉开了帷幕。在表达系统方面,真核和原核研究应 L2并不是ⅥLP组装的关键蛋白,其作用可能通过用最为广泛且各具优点。对于需要严格加工修饰的 病毒DNA的包装才得以体现 蛋白适合于真核表达系统,而看重生产工艺、产量、 L.7温度 成本等因素的蛋白则更适合原核表达。在分子层面 HPⅴⅥLP的储存也有一定的环境温度要求。上,常常需要截短N/C端数个氨基酸使得L1大量 LⅠ等人除研究表面活性剂的因素以外,针对VLP稳定表达。研究者在多次实验后发现当截短N端 溶液所处的温度也进行了探究。他将HPV11VLP不多于20个或C端不超过30个氨基酸时VLP能 从4℃环境转移至室温(22℃)放置,并监测0~10d够正常组装(N端截短10个氨基酸时形成T=1的 VLP直径变化。发现当温度从4℃逐渐升高至室“小”VLP)。除HPVL1蛋白自身因素的影响外, 温,VLP的聚集现象明显[。 外界环境因素也直接或间接的影响VLP组装。在 L.8透析 PS80等表面活性剂的参与下,pH7.2的高盐组装 ShiL等人[研究发现经透析后的VLP直径溶液、合适的储存温度和容器、L2的参与都能明显 相比透析前有所增加并会引起一定程度的聚集。且提高组装效率。将这些研究成果综合应用于HPV 其蛋白浓度降低与透析膜的尺寸成比例。可知,透VLP,能够获得纯度高、颗粒性、稳定性好的蛋白,进 析膜的吸附能力会造成VLP的聚集。 而能够提高其免疫原性与反应性,为疫苗的研发及 L.9解离后再组装 后期质控奠定了良好的基础 解离后再组装的实验方法常被用于优化VLP 目前,许多研究成果都表明HPⅤVLP免疫能 的结构。 Mach h等人发现将HPV6、HPV1l、够产生高滴度的中和抗体,上市的ⅤLP疫苗也都能 HPV16VLP解离后再组装(通过改变离子强度、pH够达到良好的预防效果。但随着抗原种类增加达到 及添加氧化还原剂等条件实现),其直径会从不规则更广泛的保护效果同时生产工艺、安全性都会成为 的30~50mm增大至理想直径60nm的规则颗粒。问题。因而市场目前迫切须要 HPV VLP的广谱疫 在物化性质方面,再组装的VLP热稳定性有5~苗的出现;另一方面,对于VLP在机体内的免疫机 10℃的提高。但并不是所有HPV都具有该特质。制的研究尚不清楚。 HPV VLP是如何进入机体内 作者提到因HPV18VLP本身在酵母细胞中都能够剌激免疫系统进行应答,其免疫效果的强弱又与 很好的组装,所以处理前后没有明显差异 VLP的哪些方面有关。针对免疫机制相关的深入 L.10机械外力因素 研究,了解VLP在机体内的免疫保护过程,对于不 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net所以 ＨＰＶ ＶＬＰ长期储存须浓缩至高浓度。 １．６ Ｌ２ 蛋白 作为同为晚期蛋白的次要衣壳蛋白 Ｌ２，其在组 装中作用的研究也未被忽略。众多研究中都提及到 ＨＰＶＬ１可以在没有 Ｌ２的参与下自组装为 ＶＬＰ。 但在真实的感染过程中，Ｌ２在包裹病毒基因进入病 原体过程中起到了关键性作 用。在１９９２年，Ｋｉｒｎ－ ｂａｕｅｒＲ等人［３３］提出 了 Ｌ２能 够 协 助 Ｌ１完 成 ＶＬＰ 结构组装的猜测。第二年，他就证明了自己的假设。 作者利 用 杆 状 病 毒 双 表 达 系 统 共 转 染 ＨＰＶ １６、 ＣＲＰＶ、ＢＰＶＬ１／Ｌ２，发现 相 比 在 仅 有 Ｌ１参 与 的 情 况 下，Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰ 产 量 提 高 了 近 ４ 倍。２００５ 年 ＩｓｈｉｉＹ 等人［３４］对 ＨＰＶ１６ＶＬＰ组装过程中 Ｌ２的 作用进行了详细的研究。研究表明Ｌ２本身不与Ｌ１ 组装后完整的 衣 壳 体 连 接，它 可 与 Ｌ１的 衣 壳 粒 即 五聚体结合形 成 复 合 物，并 且 Ｌ２可以在没有二硫 键参与的基础上辅助五聚体构成类似“小 ＶＬＰ”的 结构。Ｌ２能促使本不能形成 ＶＬＰ的 Ｌ１突变蛋白 （如 ＨＰＶ１６的 Ｃ１７５Ｓ或 Ｃ４２８Ｓ）形成 ＶＬＰ［２５］。但 Ｌ２并不是 ＶＬＰ组装的关键蛋 白，其 作 用 可 能 通 过 病毒 ＤＮＡ 的包装才得以体现。 １．７ 温度 ＨＰＶ ＶＬＰ的储存也有一定的环境温度要求。 ＬＩ等人除研 究 表 面 活 性 剂 的 因 素 以 外，针 对 ＶＬＰ 溶液所处的温度也进行了探究。他将 ＨＰＶ１１ＶＬＰ 从４℃环境转移至室温（２２℃）放置，并监测０～１０ｄ ＶＬＰ直 径 变 化。发 现 当 温 度 从４℃逐 渐 升 高 至 室 温，ＶＬＰ的聚集现象明显［２５］。 １．８ 透析 ＳｈｉＬ等人［２６］研究发现经透 析 后 的 ＶＬＰ 直 径 相比透析前有所增加并会引起一定程度的聚集。且 其蛋白浓度降低与透析膜的尺寸成比例。可知，透 析膜的吸附能力会造成 ＶＬＰ的聚集。 １．９ 解离后再组装 解离后再组 装 的 实 验 方 法 常 被 用 于 优 化 ＶＬＰ 的结 构。Ｍａｃｈ Ｈ 等 人［１１］发 现 将 ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、 ＨＰＶ１６ＶＬＰ解离后再组装（通过改变离子强度、ｐＨ 及添加氧化还原剂等条件实现），其直径会从不规则 的３０～５０ｎｍ 增 大 至 理 想 直 径６０ｎｍ 的 规 则 颗 粒。 在物化 性 质 方 面，再 组 装 的 ＶＬＰ 热 稳 定 性 有 ５～ １０℃的 提 高。但 并 不 是 所 有 ＨＰＶ 都 具 有 该 特 质。 作者提到因 ＨＰＶ１８ＶＬＰ本身在酵母细胞中都能够 很好的组装，所以处理前后没有明显差异。 １．１０ 机械外力因素 已知 ＨＰＶＶＬＰ具有较强的表面活性且部分疏 水表面暴露。在外界人为地涡流、搅拌、震荡、抽吸 等操作过程中会使得空气与溶液表面充分接触，使 得 ＶＬＰ和外界组分的相互作用增强。进而蛋白质 变性或 ＶＬＰ解离。 ２ 小结与展望 目前，ＨＰＶ ＶＬＰ除了本身作为疫苗外，还广泛 应用在嵌合 ＶＬＰ 疫 苗 以 及 作 为 ＶＬＰ 载 体［３５］。一 方面 ＶＬＰ能够接受外源片段的插入并融合表达，可 将抗 原 的 重 要 表 位 在 ＶＬＰ 表 面 进 行 展 示。Ｋａｎｄａ Ｔ 等 人［３６］构 建 了 ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２ 共 表 达 的 嵌 合 ＶＬＰ，发现免疫的家兔血清中的抗体能够中和 ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８假病 毒。另 一 方 面，有研究表明 ＶＬＰ能够作为呈递质粒 ＤＮＡ 或者 蛋白质表位的载体。 １９９２年首次发现 ＢＰＶ－１及 ＨＰＶ１６可通过杆 状病毒载体在昆虫细胞中表达 Ｌ１蛋白并自组装为 ＶＬＰ。以此为起 点，ＨＰＶ ＶＬＰ 组 装 各 方 面 的 研 究 拉开了帷幕。在表达系统方面，真核和原核研究应 用最为广泛且各具优点。对于需要严格加工修饰的 蛋白适合于真核表达系统，而看重生产工艺、产量、 成本等因素的蛋白则更适合原核表达。在分子层面 上，常常需要截短 Ｎ／Ｃ端数个氨基酸使得 Ｌ１大量 稳定表达。研究者在多次实验后发现当截 短 Ｎ 端 不多于２０个或 Ｃ端不超过３０个氨基酸时 ＶＬＰ能 够正常组装（Ｎ 端截短１０个氨基酸时形成 Ｔ＝１的 “小”ＶＬＰ）。除 ＨＰＶ Ｌ１蛋 白 自 身 因 素 的 影 响 外， 外界环境因素也直接或间接的影响 ＶＬＰ组装。在 ＰＳ８０等表面活性 剂 的 参 与 下，ｐＨ７．２的 高 盐 组 装 溶液、合适的储存温度和容器、Ｌ２的 参 与 都 能 明 显 提高组装效率。将这些研究成果综合应用于 ＨＰＶ ＶＬＰ，能够获得纯度高、颗粒性、稳定性好的蛋白，进 而能够提高其免疫原性与反应性，为疫苗的研发及 后期质控奠定了良好的基础。 目前，许多研究成果都表明 ＨＰＶ ＶＬＰ免疫能 够产生高滴度的中和抗体，上市的 ＶＬＰ疫苗也都能 够达到良好的预防效果。但随着抗原种类增加达到 更广泛的保护效果同时生产工艺、安全性都会成为 问题。因而市场目前迫切须要 ＨＰＶＶＬＰ的广谱疫 苗的出现；另一方面，对于 ＶＬＰ在机体内的免疫机 制的研究尚不清楚。ＨＰＶ ＶＬＰ是如何进入机体内 刺激免 疫 系 统 进 行 应 答，其 免 疫 效 果 的 强 弱 又 与 ＶＬＰ的哪些方 面 有 关。针 对 免 疫 机 制 相 关 的 深 入 研究，了解 ＶＬＰ在机体内的免疫保护过程，对于不 ２期 史晶洁，等．人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展 · ５５２ ·