第2期 梁建功等:蛋白质芯片及其分析应用新进展 他们首先在羰基硅烷化试剂处理的玻片上覆盖一层BAS,再将多肽和小分子蛋白样品固定。这一方法 的成功之处在于:它引进了机器人和普通商品化玻片,还成功地解决了固体表面蛋白质的活性问题。但 是,由于该方法需提纯大量的蛋白质,因而利用该方法制备高通量的蛋白质芯片是困难的,而且,蛋白质 在载玻片上的稳定时间也是有限的{12。zhu等制备了一种约含80%酵母蛋白的蛋白质组微阵列 先制备了一个含5800酵母可译框(ORFs)的高定性阵列(占全部的95%),使用重组克隆技术将其克隆 进入一个酵母高复制表达载体,再应用诱导GAL1启动子将酵母蛋白质表达在酵母上,蛋白质的氨基末 端用GsI-HisX6固定。表达在酵母上的主要目的是使蛋白质正确的修饰和折叠。使用96孔板可将来 自酵母谷胱氨酸-琼脂提取物的1152个样品提纯,随机取出60个样品进行免疫印迹分析,80%以上的 蛋白质可被检测。这项技术在一定程度上解决了蛋白质的提纯问题,然而对保持蛋白质的活性问题仍 未很好地解决。 3.2蛋白质检测芯片的制备 理想蛋白质检测芯片应该含有大量、高亲和性的、专一的蛋白质检测试剂,每种试剂检测一种特定的 蛋白质。目前人们在蛋白质检测芯片中研究较多的是抗体芯片出。Hang等在一个6cmx8cm的模 板上用计算机印刷了504个点(18×28),用于指导膜上点样。他们用2μL的吸管人工点样,每个样点 0.25μL。首先将辣根过氧化酶点在膜上作为检测向导,再将蛋白质、抗体、抗原点在膜上,最后,将膜浸入 感兴趣的蛋白质、抗体或抗原中,实现对蛋白质、抗体或抗原的高通量检测。他们还评价了不同膜制备蛋 白质芯片的优缺点。该方法快速、简便,且成本较低。它存在的主要问题有:(1)大量抗体不易得到:(2)用 增强化学发光法(ECL)检测灵敏度很高,但误差较大:(3)由于蛋白质相互作用的复杂性,用该法尚有一定 的局限性。为了寻找高专属性的蛋白质检测试剂,许多人正在制备灵敏度更高、交叉反应更少、且具有新 标记物的重组抗体和人工抗体1。但是,抗体芯片一个固有的缺点在于它能够被分析样品中的蛋白酶所 破坏。从长远来看,人们很可能会合成一些其它的试剂或采用其它的方法用于蛋白质的检测。如:将 半导体纳米量子点用于高通量蛋白质的测定。由于半导体纳米量子点具有宽的激发光谱、窄的发射光谱 及很高的量子产率,且荧光漂白速率慢,在高通量生物分析中得到了人们广泛的关注。Sm等[首先将免 疫球蛋白(IgG)固定在玻璃芯片上,然后与抗体结合,再把芯片浸入抗原溶液中,最后将浸入连有的抗体溶 液,用激光共焦扫描荧光图象分析系统进行分析。该方法灵敏度很高,但是连接与抗体连接的半导体纳米 量子点稳定性不好。本研究组和庞代文研究组采用一种简单的方法直接将抗体和抗原等物质修饰在 CdSe/ZnS核壳型半导体量子点上,方法简单,修饰后稳定性好。Johm1制备了一种纳米电极阵列芯片,该 电极的空间分布、高度、宽度和电化学成分可以变化,使得蛋白质特性的电子接收器直接建立在具有该纳 米电极的芯片上而不用任何特殊的试剂或微粒。由于它们的尺寸很小,大量不同的接受器可以作为阵列 建立在一个芯片上。该芯片可以用来检测、表征和量化溶液中单个微粒如蛋白质及复杂的蛋白质混合物 等。该阵列操作简单,但在特异性、高通量方面有待改进 4蛋白质芯片检测方法 目前蛋白质芯片主要有两种检测方法,一种为标记检测,另一种为非标记检测。 些荧光试剂如Cy3、C35、量子点等经常作为探针标记蛋白质,标记后用荧光显微镜直接观测或成 像。化学发光体系中辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及化学发光试剂异鲁米诺等也常用于蛋白质的标记 这些方法一般灵敏度较高,主要缺点是操作复杂,标记后大大改变了蛋白质的表面特征,尤其是在改变 赖氨酸侧链正电荷时,可能在很大程度上导致蛋白质的变性。另一种标记方法是同位素标记法。为了 克服质谱技术中无法区别两个样品中同一蛋白的缺陷 Kodadek l0报道 Aebersold等应用了同位素标记 技术,这种标记技术类似于两种颜色的标记。同荧光标记技术一样,同位素标记技术也有很多缺陷而不 能很好地用于蛋白质芯片检测 在蛋白质芯片的检测研究中,一个主要的发展方向是设计一种不需要任何样品标记的检测方法。 靳刚将生物光学显微镜成像技术和集成化多元蛋白质芯片技术结合,设计了一种新型光学蛋白质芯 片。利用光学显微镜可直接检测蛋白质的相互作用。该方法样品用量少、无需标记、快速简便。然而它他们首先在羰基硅烷化试剂处理的玻片上覆盖一层 !"#，再将多肽和小分子蛋白样品固定。这一方法 的成功之处在于：它引进了机器人和普通商品化玻片，还成功地解决了固体表面蛋白质的活性问题。但 是，由于该方法需提纯大量的蛋白质，因而利用该方法制备高通量的蛋白质芯片是困难的，而且，蛋白质 在载玻片上的稳定时间也是有限的［$%］ 。&’( 等［$)］制备了一种约含 *+, 酵母蛋白的蛋白质组微阵列， 先制备了一个含 -*++ 酵母可译框（./01）的高定性阵列（占全部的 2-, ），使用重组克隆技术将其克隆 进入一个酵母高复制表达载体，再应用诱导 3"4$ 启动子将酵母蛋白质表达在酵母上，蛋白质的氨基末 端用 3#567819: 固定。表达在酵母上的主要目的是使蛋白质正确的修饰和折叠。使用 2: 孔板可将来 自酵母谷胱氨酸6琼脂提取物的 $$-% 个样品提纯，随机取出 :+ 个样品进行免疫印迹分析，*+, 以上的 蛋白质可被检测。这项技术在一定程度上解决了蛋白质的提纯问题，然而对保持蛋白质的活性问题仍 未很好地解决。 !; " 蛋白质检测芯片的制备 理想蛋白质检测芯片应该含有大量、高亲和性的、专一的蛋白质检测试剂，每种试剂检测一种特定的 蛋白质。目前人们在蛋白质检测芯片中研究较多的是抗体芯片［$<］ 。7(=>? 等［$-］ 在一个 : @A B * @A 的模 板上用计算机印刷了 -+< 个点（$* B %*），用于指导膜上点样。他们用 % !4 的吸管人工点样，每个样点 +C %- !4。首先将辣根过氧化酶点在膜上作为检测向导，再将蛋白质、抗体、抗原点在膜上，最后，将膜浸入 感兴趣的蛋白质、抗体或抗原中，实现对蛋白质、抗体或抗原的高通量检测。他们还评价了不同膜制备蛋 白质芯片的优缺点。该方法快速、简便，且成本较低。它存在的主要问题有（：$）大量抗体不易得到（；%）用 增强化学发光法（DE4）检测灵敏度很高，但误差较大（；)）由于蛋白质相互作用的复杂性，用该法尚有一定 的局限性。为了寻找高专属性的蛋白质检测试剂，许多人正在制备灵敏度更高、交叉反应更少、且具有新 标记物的重组抗体和人工抗体［$:］ 。但是，抗体芯片一个固有的缺点在于它能够被分析样品中的蛋白酶所 破坏［$<］ 。从长远来看，人们很可能会合成一些其它的试剂或采用其它的方法用于蛋白质的检测。如：将 半导体纳米量子点用于高通量蛋白质的测定。由于半导体纳米量子点具有宽的激发光谱、窄的发射光谱 及很高的量子产率，且荧光漂白速率慢，在高通量生物分析中得到了人们广泛的关注。#(> 等［$F］ 首先将免 疫球蛋白（G?3）固定在玻璃芯片上，然后与抗体结合，再把芯片浸入抗原溶液中，最后将浸入连有的抗体溶 液，用激光共焦扫描荧光图象分析系统进行分析。该方法灵敏度很高，但是连接与抗体连接的半导体纳米 量子点稳定性不好。本研究组和庞代文研究组采用一种简单的方法直接将抗体和抗原等物质修饰在 EH#I J &># 核壳型半导体量子点上，方法简单，修饰后稳定性好。KL’> ［$*］ 制备了一种纳米电极阵列芯片，该 电极的空间分布、高度、宽度和电化学成分可以变化，使得蛋白质特性的电子接收器直接建立在具有该纳 米电极的芯片上而不用任何特殊的试剂或微粒。由于它们的尺寸很小，大量不同的接受器可以作为阵列 建立在一个芯片上。该芯片可以用来检测、表征和量化溶液中单个微粒如蛋白质及复杂的蛋白质混合物 等。该阵列操作简单，但在特异性、高通量方面有待改进。 $ 蛋白质芯片检测方法 目前蛋白质芯片主要有两种检测方法，一种为标记检测，另一种为非标记检测。 一些荧光试剂如 EM)、EM-、量子点等经常作为探针标记蛋白质，标记后用荧光显微镜直接观测或成 像。化学发光体系中辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及化学发光试剂异鲁米诺等也常用于蛋白质的标记。 这些方法一般灵敏度较高，主要缺点是操作复杂，标记后大大改变了蛋白质的表面特征，尤其是在改变 赖氨酸侧链正电荷时，可能在很大程度上导致蛋白质的变性。另一种标记方法是同位素标记法。为了 克服质谱技术中无法区别两个样品中同一蛋白的缺陷，NLH=HIO ［$+］ 报道 "IPIQ1LH 等应用了同位素标记 技术，这种标记技术类似于两种颜色的标记。同荧光标记技术一样，同位素标记技术也有很多缺陷而不 能很好地用于蛋白质芯片检测。 在蛋白质芯片的检测研究中，一个主要的发展方向是设计一种不需要任何样品标记的检测方法。 靳刚［$2］ 将生物光学显微镜成像技术和集成化多元蛋白质芯片技术结合，设计了一种新型光学蛋白质芯 片。利用光学显微镜可直接检测蛋白质的相互作用。该方法样品用量少、无需标记、快速简便。然而它 第 % 期 梁建功等：蛋白质芯片及其分析应用新进展 %<-