实验十脲酶Km值测定 一、目的 脲酶是氨素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进 土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。对其进行多方面研究，早己引起人 们重视。通过本实验，学习脲酶Km值的测定方法。 二、原理 脲酶催化下列反应： 0NH,C0+2H0NH,c0, 在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范 围内 深浅与碳酸铵量成正 故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产 生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。 (NH)2CO,+8NaOH+4(KI)2Hgl2- Hg 20 NH2I +6Nal +8KI+NazCO+6H2O 橙黄色) 在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合 反应。在一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。用双倒数作图法可求得脲 酶的Km值。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 1)试管 16×160mm21支 (2)吸管0.5ml×15,1ml×1,Zml×1,10ml×1 (3)漏斗5个 (4)721型分光光度计 (5)电热恒温水浴 (6)离心机 (7)康氏振荡机 2.试剂 (1)1/10mol/L脲 15.015g,水溶后定容至250ml (2)不同浓度脲液 用1/10mol/L脲稀释成1/20、1/30、1/ 40、1/50mol/L的脲液。 (3)1/15mo/LpH7.0磷酸盐缓冲液NaHPO45.969g,水落后定 容至250ml。NaHP0:2.268g,水溶后定容至250ml.取Na:HPO4溶液60ml, NaH:PO,溶液40ml混匀 ,即为1/15mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液。 (4)10%疏酸锌 20gZnS04溶于200ml蒸馏水中。 (5)0.5mol/L氢氧化钠5 gNaOH,水溶后定容至250ml。 (6)10%酒石酸钾钠 20g酒石酸钾钠溶于200ml蒸馏水中。 实验十 脲酶 Km 值测定 一、目的 脲酶是氮素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进 土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。对其进行多方面研究，早已引起人 们重视。通过本实验，学习脲酶 Km 值的测定方法。 二、原理 脲酶催化下列反应： 在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范 围内，呈色深浅与碳酸铵量成正比。故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产 生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。 在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合 反应。在一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。用双倒数作图法可求得脲 酶的 Km 值。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）试管 16 × 160mm 21 支 （2）吸管 0.5ml×15，lml×1，Zml×1，10ml×1 （3）漏斗 5 个 （4）721 型分光光度计 （5）电热恒温水浴 （6）离心机 （7）康氏振荡机 2．试剂 （1）1／10 mol／L 脲 15.015g，水溶后定容至 250ml。 （2）不同浓度脲液 用 1／10 mol／L 脲稀释成 1／20、1／30、1／ 40、l／50 mol／L 的脲液。 （3）1 ／15 mo／L pH7．0 磷酸盐缓冲液 Na2HPO4 5.969g，水溶后定 容至 250ml。NaH2PO4 2.268g，水溶后定容至 250ml。取 Na2HPO4 溶液 60ml， NaH2PO4 溶液 40ml 混匀，即为 1／15 mol／L pH7.0 磷酸盐缓冲液。 （4）10％硫酸锌 20g ZnSO4 溶于 200ml 蒸馏水中。 （5）0.5 mol／L 氢氧化钠 5g NaOH，水溶后定容至 250ml。 （6）10％酒石酸钾钠 20g 酒石酸钾钠溶于 200ml 蒸馏水中