根据系谱分析,此病为线粒体遗传的方式。可能为线粒体遗传病 Leber遗传 性视神经病(LHON),为确诊,对先证者和家族其他患者进行基因诊断。 (二)基因诊断 诱发LHON的mDNA突变均为点突变。如:G11778A、G14459A、G3460A、 T14484C、G15257A等,它们都位于呼吸链酶复合物I(ND1ND2ND4和ND5) 和呼吸链酶复合物Ⅲ(CytC)基因中。其中G11778A最为常见 1. PCR-RFLP法检测线粒体基因G11778A突变 (1)抽取外周血,ACD抗凝。 (2)抽提基因组DNA(详见第二篇)。 (3)PCR扩增与限制性内切酶消化。 设计 mtDNA1178引物 Primer:5′- ATGGCAAGCCAACGCCACTT-3′ Primer2:5′ CGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC-3′ PCR反应参数:94℃预变性300s,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃ 延伸30s,共30个循环,末轮72℃再延伸300s。 扩增产物10μl加限制性内切酶 SfaNi4U,37℃水浴消化12h。2%琼脂 糖凝胶电泳检测, Eagle EyeⅡ凝胶成像分析仪成像拍照。 图4-22M标准分子量Matr1mDNA7RPCR扩增条带2:对照组 CR产物酶切后条带3:无家族史患者酶切条带4~9家系成员酶切条带 mtDNA突变检测结果显示正常人 mtDNA11778位点经PCR扩增后,可得到 一条长924bp的扩增片段,经 SfaN I酶切后可产生797bp+127bp两条片段。而 LHON患者因 mtDNA11778A突变,丢失酶切位点而只能出现一条长924bp的 片段(图4-2-2)。 PCR-RFLP法检测证实患者有线粒体DNA11778位点的突变,可以确定是根据系谱分析，此病为线粒体遗传的方式。可能为线粒体遗传病 Leber 遗传 性视神经病（LHON），为确诊，对先证者和家族其他患者进行基因诊断。 （二）基因诊断 诱发 LHON 的 mtDNA 突变均为点突变。如：G11778A、G14459A、G3460A、 T14484C、G15257A 等，它们都位于呼吸链酶复合物Ⅰ（ND1,ND2,ND4 和 ND5） 和呼吸链酶复合物Ⅲ（Cyt C）基因中。其中 G11778A 最为常见。 1. PCR-RFLP 法检测线粒体基因 G11778A 突变 （1）抽取外周血，ACD 抗凝。 （2）抽提基因组 DNA（详见第二篇） 。 （3）PCR 扩增与限制性内切酶消化。 设计 mtDNA 11778 引物 Primer1 : 5′- ATGGCAAGCCAACGCCACTT - 3′; Primer2 : 5′- CGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC - 3′ PCR 反应参数：94 ℃预变性 300s，94 ℃变性 30s，58 ℃退火 30s，72 ℃ 延伸 30s，共 30 个循环，末轮 72 ℃再延伸 300s。 扩增产物 10μl 加限制性内切酶 SfaNI 4U，37 ℃水浴消化 12h。2 %琼脂 糖凝胶电泳检测，Eagle Eye Ⅱ凝胶成像分析仪成像拍照。 图4-2-2 M:标准分子量Marker 1 :mtDNA11778 PCR 扩增条带 2 : 对照组 PCR 产物酶切后条带 3 :无家族史患者酶切条带 4～9 :家系成员酶切条带 mtDNA 突变检测结果显示正常人mtDNA11778 位点经PCR扩增后，可得到 一条长924bp 的扩增片段，经SfaN I 酶切后可产生797bp + 127bp 两条片段。而 LHON 患者因mtDNAG11778A 突变，丢失酶切位点而只能出现一条长924bp 的 片段（图4-2-2）。 PCR-RFLP法检测证实患者有线粒体DNA11778位点的突变，可以确定是