或者在提取过程中释放的核酸酶的存在,会降低DNA的最终收货量,或导致纯化的质粒容 易降解。核酸酶的污染可以使用核酸酶去除溶液等进行预处理。常用的宿主菌株除了 HB101外,不含内源核酸酶的宿主菌株DH5a和TOP10也是推荐的。最终收获量取决于质 粒DNA拷贝数和质粒的大小。本实验所用的pBR322的拷贝数是15-20,理想情况下1m菌 液质粒DNA收获量是06-1μg。从固体培养基平板上挑取一个单菌落,接种到LB培养液 中,37°C振荡培养过夜,应控制在12-16h,不应超过16h,以为此时细胞会开始裂解,使 得质粒的获得量降低,也会导致质粒丢失或质粒变异 影响琼脂糖凝胶电泳DNA分子迁移率的因素 DNA在凝胶中迁移率的主要影响因素有DNA分子的大小及构型、琼脂糖的浓度、DNA的 分子构象、所加电压、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成及其离子强度等。 不同构型DNA的移动速度次序为:共价闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA。线 状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速度与DNA分子量对数成反比,分子越大 所受的阻力越大,在就越难在凝胶空隙中运动。 这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度。当琼脂糖浓度太高时,环状DNA不能进入 胶中,相对迁移率为零,而同等大小的直线双链DNA可以长轴方向前进。一个固定大小的 线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂凝胶中各不同。DNA电泳迁移率的对数和凝 胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。本实验DNA大小位于 0.5kb-10kb之间,选用的凝胶浓度是1%比较合适 质粒DNA酶切后形成3种构象,其泳动速度顺序为:超螺旋>线性>开环,可能产生不同 条带。理想条件下,经碱裂解法纯化到的质粒DNA,应该只出现超螺旋一条带。但在质粒 提取过程中机械力,强碱溶液的作用等原因,纯化到的质粒常常会出现三条带,甚至有时 候会出现四条带(变性超螺旋),不管是哪种形式的超螺旋,经单酶切后,呈现一条带, 则说明提取结果正常,没有基因组污染。本实验结果显示,基因组的污染很轻微,并没有 显示出明显的其他条带。 一般情况下,在低浓度、低电压实验条件下,分离效果较好。在低电压条件下,线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但在电场强度增加时,不同分子量的DNA段的迁 移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电 压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。 此外,嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成及离子浓度也会影响迁移率。本次实验所用染 料是较为安全的 gelLed荧光染料溴化乙锭会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状DNA 和带缺口的环状DNA,使得线状DNA迁移率降低。不同组成的电泳缓冲液有各自特点,适 用于不同片段DNA或实验要求,总体来说,TAE缓冲液应用范围广泛,大片段分离效果 好,超螺旋在其中电泳更符合实际分子质量。电泳缓冲液的离子浓度不宜过高,否则会导 致DNA变形甚至凝胶融化。 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250