DNA重组与细胞转化及重组 DNA的提取和酶切鉴定 实验组员:王晨辰,王嘐嘐,宋杨 指导老师:潘鸾凤,王松梅 实验时间:2012.09.14.2012.0921 实验目的 学习DNA克隆技术和细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义,掌握氯化钙制备大 肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌并筛选转化的方法;学习和掌握质粒的快速 提取纯化、限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳等方法和技术。 实验原理 DNA重组与细胞转化 将用EcoR和Ca出来的14 kb c-myc DNA片段在T4DNA连接酶的作用下,连接入同样 经EcOR和Ca切开的pBR322质粒载体上,以 E coli HB101菌株为受体细胞,用CaC处 理受体菌使其处于感受态,然后与pBR322质粒共保温,实现转化。pBR322质粒谢带有抗 氨苄青霉素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性,用Amp表 示。将经过转化后的受体细胞在含氨苄青霉素的平板培养基上培养,只有转化体才能存 活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 重组质粒的提取及酶切鉴定 因质粒在细胞内具有高拷贝数,本实验用小量制备法抽提质粒DNA即可获得足量DNA用于 基因操作。本实验采用碱变性法抽提质粒,其原理是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与 复性的差异而达到分离目的。在pH高达126的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,染 色体DNA的氢键断裂,双螺旋解构变性,而质粒DNA超螺旋共价闭合环状的两条互补链不 会完全分离,用pH4.8NaAc高盐缓冲液重新调节pH至中性时,质粒DNA复性,而染色体 DNA不能复性,通过离心,与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来 而被除去。分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤:(1)培养细菌使质粒扩增;(2)收 集和裂解细菌;(3)分离和纯化质粒DNA。十二烷基硫酸钠(SDS)可使细胞壁裂解, 细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
液中。用乙醇沉淀、洗涤,可得到质粒DNA。将经限制性内切酶EXOR|和cla酶切的质粒 DNA进行琼脂糖凝胶电泳,将出现两条区带:43 kb pBr322质粒载体片段和14 kb c-myc 目的基因片段。 实验器材和试剂 器材 恒温摇床,电热恒温箱培养箱,无菌操作超净台,恒温振荡器,电热恒温水浴,台式离心 机,低温高速离心机,漩涡振荡器,电泳槽及电泳仪,紫外观察仪,移液枪和枪头,细 菌培养管,15 ml Eppendorf管,15m离心管,冰浴,接种环,长玻璃试管,滴管,刻度 吸管等。 试剂 用EcoR|和cal处理的pBR322线状DNA(20ng/仙;用EcoR|和cal处理的14 kb c-myc DNA片段(20ng/u);T4DNA连接酶(0Uu);10×连接酶缓冲液;6×凝胶加样缓冲 液;已经装有cmyc目的片断的pBR322质粒DNA(5ng/u);LB培养基;含琼脂的LB培 养基;0.1 mol/L CaC|2;氨苄青霉素储存液;提取重组质粒DMA试剂盒(包含LB培养基, Buffer s1, Buffer S2, Buffer S3, RNase A, 1xTAE: BufferW1, BufferW2 Eluent);10xmui- core buffer; EcoR I;cal;乙酰化BSA; gelLed; Agarose等。 实验步骤 DNA重组与细胞转化 DNA片段连接 1)向1.5 ml Eppendorf管中加入连接反应物如下 14kb目的基因片段(20ng/)2.5μ 4.3kb载体DNA(20ng小p)25 10x连接 Buffer dd h20 3.5 T4DNA连接酶 05μl 总体积 10 2)混匀并短暂离,置于16°水浴中温育2小时 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
2.制备感受态细胞 1)用移液枪移取0.1m大肠杆菌菌液,加入已装有5mlLB培养液的玻璃试管中。于37℃C 温箱中振摇培养2小时,直至内眼呈云雾状。 2)在酒精灯旁将该5m细菌培养物倒入冰预冷的15m离心管中,冰浴10min。 3)4000m下冷离心10mn 4)酒精灯旁弃去离心管上清,并于纸巾上控干剩余液体。用1m0.1 mol/L CaC|2重悬沉 淀,吹打均匀,移入15 ml Eppendorf管中,冰浴10min 5)4000rpm下冷离心10mn 6)再次于酒精灯旁弃去管内上清,并于纸巾上控干剩余液体。用200p0.1 mol/L CaC2重 悬沉淀,吹打均匀,使细菌处于感受态。 7)分别分装50感受态细菌于两只新 Append管中,分别标记为“转化和+”(阳性对 照),立即转化。 3.转化 1)在酒精灯旁分别向两管中加入1连接产物质粒DNA和已知阳性对照质粒DNA。冰浴 30min。 2)42℃水浴中热休克90s,迅速取出。 3)在无菌条件下分别加人LB培养液150μ,盖好管盖,37℃振摇45min使其复苏 4)在酒精灯旁分别从两管中取100u菌液,分别于含AmpC(60pg/m)的LB平板上涂板 (分别标记为“转化”和+"),令其均匀分布,放入37℃温箱中倒置2小时,待液体充分收 干后改为平放,继续在37C下培养过夜 重组DNA的提取和酶切鉴定 1.重组质粒的小量快速制备 1)在50m离心试管中加入10m含60 uIml Amp的LB培养液,从重组质粒转化细菌涂布的 平板上挑取一个单菌落接种于其中,37℃温箱中震荡培养过夜。 2)取 Eppendo一只,向其中倒入15m菌液,12000×g离心1min,弃去上清,并于纸巾 上控干液体 3)重新向 Eppendor中倒入15m菌液,再次12000×g离心1mn,弃上清,纸巾上控干液 体 晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
4)加入250u已含 RNase A的 Buffer s1,轻轻用加样枪吹打、悬浮细菌沉淀,直至均 5)加入250μ Buffer s2,立即盖好 Eppendorf盖,轻轻将其上下颠倒10次,见菌液逐渐变 清 6)迅速加入350μ I Buffer S3,盖好管盖,温和并充分地上下翻转混合8次,12000xg离心 10min。 7)将移液枪旋至800μ,小心吸取离心后上清,转移至2m离心管中的制备管中 12000Xg离心1min,弃去滤液。 8)将制备管放回离心管,加入500 Buffer w1,12000Xg离心1min,弃去滤液。 9)将制备管放回离心管,加入700 Buffer w2,120009离心1min,弃去滤液。 10)用700 Buffer w2重复洗涤1次,12000xg离心min,弃去滤液。 11)将制备管放回离心管,12000Xg空离心1min 12)取出制备管,移入新的15m的离心管中,向制备管膜中央加入65℃水浴预热 Eluent 液体40,静置1min,12000g离心1min,弃去制备管。 2.质粒DNA的限制性内切酶双酶切鉴定 1)酶切 取一只15 ml Eppendor管,标记为酶切”,向其中加入酶切反应物如下 10xmulti-core buffer 2 ul EcoR I(16u/Hl) Cla I(10 u/uD dd H20 6山l 质粒DNA溶液 10叫 总体积 20 ul 混匀后短暂离心,37℃水浴1小时。 2)电泳 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
a.配制40m1% Agrose溶液:称取 Agrose049,放入250m烧瓶中,加入40m1xTAE溶 液,置微波炉中大火加热1mn左右,沸腾后打开炉门,轻轻摇晃瓶身,待气泡消失后重新 加热5s,再次沸腾后摇晃瓶身,重复3次,至溶解均匀完全。 b.放置电泳板于水平桌面上,插上梳子。待 Agrose溶液冷却至50℃C左右时,加入EB溶液 (10mg/m)2μl,摇晃瓶身使之混匀,立即浇板,水平桌面上静置待凝。 C.胶凝后轻轻拔去梳子,放入电泳槽,向槽中加入1xTAE至浸没凝胶。 d.上样:依次按如下样品混匀,向上样孔内加样并标记为AB,C A孔:5μ Marker(0.1pg/u)+1p6 lOading Buffer B孔:10叫抽提出的pBR322重组质粒DNA含14 kb c-myc基因)+2pl6× Loading uffer C孔:20μ酶切产物+4pl6 LOading Buffer; e,电泳:盖上电泳槽盖,接通电源,加样孔位于负极,在5Vcm电压下电泳,待溴酚蓝跑 到凝胶12处停止电泳。 f.紫外灯下观察结果并拍照留档 实验结果 DNA重组与细胞转化(Fig1Fig2) 培养基内转化组(Fig1)和阳性对照组(Fig2)均有菌落生长,转化组培养基上的菌落数量 明显多于阳性对照组。转化组的菌落数约为250个,而阳性对照组培养基上生长的菌落数 约为20个。转化组的菌落生长分布较均匀密集,而阳性对照组的菌落分布零散。说明实验 成功,目的基因连接到载体形成重组质粒,转化体大肠杆菌由于携带抗Amp的基因,能在 选择性培养基Amp抗性平板生长,实现了转化体的筛选。 重组质粒的提取及酶切鉴定(Fig3Fig.4) 重组质粒DNA(含14kbc-myc基因)(B)电泳后表现为一条条带,位于约35kb处;酶切 产物(C)电泳后表现为两条条带,位置上大致与43kb和14kb相符合,前者应为质粒载 体片段,后者应为目的基因片段。图中可见两组条带的边缘均带毛刺和阴影,其他样孔 是另外两个实验组的结果,可见最左边实验组较我组结果,条带更加清晰,边缘更加平 整。造成该现象的原因将在讨论中进行分析。 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
(+十 S w 50J 28 30n2-- ￥:0 Fig 2 兰想 4.3kb 1.4kb g Fig 4 晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
讨论 影响转化效率的因素 感受态细菌的效价、质粒DNA与受体菌的比例和转化的条件等都会影响重组DNA转化大肠 杆菌的效率。对数中期的大肠杆菌容易生成感受态,细菌培养时间不能过长也不能过短, 否则对感受态细胞的制备造成负面影响。转化时细菌的浓度转不能太高,一般认为不超过 10E7/m。本实验大肠杆菌培养的时间是15-2h,培养后肉眼可见成雾状,推测其正处对 数生长期。本实验载体与目的基因的摩尔比约为1:3,是较优比例。细菌经0°CCaC|处 理后转化率随时间的推移而增加,也是一个影响因素,转化率至24h达到高峰,随后逐渐 下降 实验中的缓冲液的成分和酶的浓度及用量也是影响因素。缓冲液中适量Mg2+、ATP、 DT作为辅助,可以提供能量,也可以有助于稳定酶活性。一般情况下,连接酶的用量越 多越好,尤其是在其活力下降时,但是由于连接酶保存在50%甘油中,若连接反应系统中 甘油含量过高,会影响连接效果。但是若连接酶本身纯度不佳,加入到一定浓度后,再增 加用量对增快反应速度并无明显益处,反而会突显其他杂酶的作用。转化的条件还包括温 度的控制,尤其是连接有目的基因片段的质粒DNA在短暂的热休克状态下进入感受态细胞 时,温度和时间都应该严格掌控,转移速度要快,温度要准确。另外,连接反应的温度选 择为12-16°C,是这种采取催化反应与末端粘合的温度。 此外,目的基因的本身大小和构型也会影响转化效率,通过构建相同复制起点的不同大小 质粒进行转化时发现,从2k到3.2kb的转化效率上升,此后到66kb转化效率线性下降。 同时,开环状质粒只有超螺旋质粒转化率的75%,线型质粒的转化率更要低100~1000 倍,线型转化率低的主要原因是菌体中核酸外切酶将进入的线型DNA降解。当然,实验人 员操作和仪器的正确使用也是变化因素。我组在实验过程中较为严格地遵守了无菌原则 也严格遵照了实验步骤和注意事项。 影响质粒DNA提取和纯化的因素 本实验运用碱裂解法提取质粒DNA,使用的是 AXYGEN试剂盒。原理是溶液使细胞悬浮 并且EDTA与Ca2+和Mg2+螯合,抑制 DNase的活性,溶液l裂解细菌,变形蛋白质和少量 治疗,溶液Ⅲ使大部分蛋白质和细菌基因组DNA一起沉淀,质粒DNA复性。裂解细菌主要 是溶液川中的NaOH,因此与空气中的CO2隔离很重要,避免使其碱性降低,从而使得裂 解细菌的能力减弱。另外,混匀动作要轻柔,以免强碱在剧烈振动下使得DNA片段断裂 使得大量基因组DNA片段混入而影响质粒DNA提取的纯度。 质粒DNA提取的效率和纯度直接影响到后阶段实验的成功与否,宿主菌株和培养条件、质 粒拷贝数、质粒稳定性、所用的主要试剂、吸附柱的吸附量等都是主要的影响因素。本实 验选用HB101,此菌株和它的衍生菌株会在裂解时产生大量糖类,如果没有完全去处,将 抑制后续实验中酶活性,影响质粒DNA提取的质量,也会因为其本身内源核酸酶的存在, 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
或者在提取过程中释放的核酸酶的存在,会降低DNA的最终收货量,或导致纯化的质粒容 易降解。核酸酶的污染可以使用核酸酶去除溶液等进行预处理。常用的宿主菌株除了 HB101外,不含内源核酸酶的宿主菌株DH5a和TOP10也是推荐的。最终收获量取决于质 粒DNA拷贝数和质粒的大小。本实验所用的pBR322的拷贝数是15-20,理想情况下1m菌 液质粒DNA收获量是06-1μg。从固体培养基平板上挑取一个单菌落,接种到LB培养液 中,37°C振荡培养过夜,应控制在12-16h,不应超过16h,以为此时细胞会开始裂解,使 得质粒的获得量降低,也会导致质粒丢失或质粒变异 影响琼脂糖凝胶电泳DNA分子迁移率的因素 DNA在凝胶中迁移率的主要影响因素有DNA分子的大小及构型、琼脂糖的浓度、DNA的 分子构象、所加电压、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成及其离子强度等。 不同构型DNA的移动速度次序为:共价闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA。线 状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速度与DNA分子量对数成反比,分子越大 所受的阻力越大,在就越难在凝胶空隙中运动。 这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度。当琼脂糖浓度太高时,环状DNA不能进入 胶中,相对迁移率为零,而同等大小的直线双链DNA可以长轴方向前进。一个固定大小的 线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂凝胶中各不同。DNA电泳迁移率的对数和凝 胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。本实验DNA大小位于 0.5kb-10kb之间,选用的凝胶浓度是1%比较合适 质粒DNA酶切后形成3种构象,其泳动速度顺序为:超螺旋>线性>开环,可能产生不同 条带。理想条件下,经碱裂解法纯化到的质粒DNA,应该只出现超螺旋一条带。但在质粒 提取过程中机械力,强碱溶液的作用等原因,纯化到的质粒常常会出现三条带,甚至有时 候会出现四条带(变性超螺旋),不管是哪种形式的超螺旋,经单酶切后,呈现一条带, 则说明提取结果正常,没有基因组污染。本实验结果显示,基因组的污染很轻微,并没有 显示出明显的其他条带。 一般情况下,在低浓度、低电压实验条件下,分离效果较好。在低电压条件下,线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但在电场强度增加时,不同分子量的DNA段的迁 移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电 压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。 此外,嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成及离子浓度也会影响迁移率。本次实验所用染 料是较为安全的 gelLed荧光染料溴化乙锭会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状DNA 和带缺口的环状DNA,使得线状DNA迁移率降低。不同组成的电泳缓冲液有各自特点,适 用于不同片段DNA或实验要求,总体来说,TAE缓冲液应用范围广泛,大片段分离效果 好,超螺旋在其中电泳更符合实际分子质量。电泳缓冲液的离子浓度不宜过高,否则会导 致DNA变形甚至凝胶融化。 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250
结语 综上所述,本次实验我们组成功采用粘端连接法将cmyc外源DNA片段连接到pBR322质 粒载体中,用氯化钙法制备 E coli HB101感受态细胞,转化含有目的基因的pBR322质 粒,并在含抗Amp平板培养基上筛选出转化体,用碱性SDS方法将重组质粒从大肠杆菌中 分离并提取质粒DNA,再经限制性内切酶酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳分离, gelLed染 色,在紫外灯下检测并得到实验结果。实验过程顺利,达到了本实验的目的和要求。 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250