实验二重组DNA的 提取及酶切鉴定 复旦大学上海医学院医学实验教学中心 王松梅 021-54237330;smwang2@fudan.edu.cn
1 实验二 重组DNA的 提取及酶切鉴定 复旦大学上海医学院医学实验教学中心 王松梅 021-54237330; smwang2@fudan.edu.cn
、实验目的 掌握以下方法和技术: 1.质粒DNA的小量快速制备 2.质粒DNA的限制性内切酶酶切 3.DNA的琼脂糖凝胶电泳
2 一、实验目的 掌握以下方法和技术： 1. 质粒DNA的小量快速制备 2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切 3. DNA的琼脂糖凝胶电泳
二、实验原理 1.质粒DNA的小量快速制备 分离质粒DNA有三个步骤: 1)培养细菌使质粒扩增 2)收集和裂解细菌(本实验:SDS裂解) 3)分离和纯化质粒DNA(本实验:碱变性法)
3 二、实验原理 分离质粒DNA有三个步骤： 1） 培养细菌使质粒扩增 2） 收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解） 3）分离和纯化质粒DNA（本实验：碱变性法） 1. 质粒DNA的小量快速制备
碱变性法抽提质粒DNA Solution II Solution III 离心后去向 pH12. 6 pH4.8 染色体DNA 氢键断裂,双螺 旋解开 不能完全复性沉淀中 氢键部分断裂, 质粒 DNA CCcDNA互补链复性 上清中 不完全分离
4 碱变性法抽提质粒DNA Solution II pH12.6 Solution III pH4.8 离心后去向 染色体DNA 氢键断裂，双螺 旋解开 不能完全复性 沉淀中 质粒DNA 氢键部分断裂， cccDNA互补链 不完全分离 复性 上清中
质粒的纯化方法 层析法:常用 离心法:经典,纯度高 达电泳法 沉淀法:大量
质粒的纯化方法 层析法：常用 离心法：经典，纯度高 电泳法 沉淀法：大量
硅基质材料(树脂)纯化质粒DNA DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水,使 得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸 附,一般的洗液不能将其洗脱下来,只有水溶性的缓冲液, 如TE或水重新水化后,DNA才能从层析柱上定量回收
6 硅基质材料(树脂）纯化质粒DNA DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水，使 得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸 附，一般的洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲液， 如TE或水重新水化后，DNA才能从层析柱上定量回收
2.质粒DNA的限制性内切酶酶切 c-myc基因片段4.8kb BamH I+XbaI双酶切(酶切完全时) 琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带 Sv-c-mvc 8.3kb 35 kb pSV2载体片段 Bamh I Xba l 48 Bkb c-myc目的基因片段 pSV2载体片段 3.5kb
7 2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切 BamH I + Xba I双酶切（酶切完全时） 琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带 3.5kb pSV2载体片段 4.8kb c-myc 目的基因片段 pSV-c-myc 8.3kb BamH I Xba I c-myc基因片段4.8 kb pSV2载体片段 3.5kb
3.琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖——海藻中提取的线状高聚物 加热融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝胶
8 琼脂糖——海藻中提取的线状高聚物 加热融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝胶 3. 琼脂糖凝胶电泳
表51不同类型琼脂的慢质 瑯丽糖类型 凝结温度代 熔化温度/℃ 商品名 标准琼盟糖 low EEO 35~38 ShaKen LE (Bo Whittaker) 从 Gelidium app分离 groMe LE (USB) Low EEO Agrose(Stratagene) Molecular Biology Certified Grade 标准欢糖 low EEO 40~42 SeaKem hgt【 Bowhittakey) 从 gracilari分寫 Agrose HGT (USB) 高强度麻脂糖 Fastlane(Bio Whittaker) (Bio-Rad) 修饰的低烙点/凝点球脂糖 低熔点 25-35 35 65 NuSieve(BioWhittaker) 超低熔点 sPrep(BioWhittaker) 低黏性低爆点球脚糖 InCert(Biowhittaker) 38 NuSieve 3:1(BioWhittaker) 9
9
DNA在凝胶中的迁移率的影响因素 DNA分子的大小 琼脂糖的浓度 DNA的构象 所加电压 嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成及其离子强度
10 DNA在凝胶中的迁移率的影响因素 DNA分子的大小 琼脂糖的浓度 DNA的构象 所加电压 嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成及其离子强度