表观遗传分析技术
表观遗传分析技术
/表观遗传学的研究热点 DNA甲基化 组蛋白共价修饰 染色质重塑 基因组印记 RNA调控 非编码RNA
表观遗传学的研究热点 3 DNA甲基化 组蛋白共价修饰 染色质重塑 基因组印记 RNA调控 非编码RNA
DNA甲基化分析技术 根据研究目的: (1)基因组整体水平甲基化分析 (2)特异位点的DNA甲基化检测 (3)甲基化新位点的寻找 依据对目标DNA预处理将检测技术分为3大类: (1)基于甲基化敏感的限制性内切酶预处理 (2)基于重亚硫酸盐的预处理 (3)基于亲和富集预处理
一、DNA甲基化分析技术 依据对目标DNA预处理将检测技术分为3大类： （1）基于甲基化敏感的限制性内切酶预处理 （2）基于重亚硫酸盐的预处理 （3）基于亲和富集预处理 根据研究目的： （1）基因组整体水平甲基化分析 （2）特异位点的DNA甲基化检测 （3）甲基化新位点的寻找
垂/(一)基因组整体水平甲基化分析 1.甲基化敏感的限制性内切酶法 2.重亚硫酸盐的甲基化分析方法 3.高效液相色谱法(HPLC) 4.高效毛细管电泳法(HPCE 5.变性高效液相色谱法( DHPLO) 6.免疫化学法
（一）基因组整体水平甲基化分析 1. 甲基化敏感的限制性内切酶法 2. 重亚硫酸盐的甲基化分析方法 3. 高效液相色谱法（HPLC） 4. 高效毛细管电泳法（HPCE) 5. 变性高效液相色谱法（DHPLC） 6. 免疫化学法
/1.甲基化敏感的限制性内切酶(MSR法 methy latⅰ on sensitive restriction endonuc ease,MSRE是一类 对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶,它们的识别位点中 含有CpG双核苷酸序列,往往只能结合非甲基化的识别序列,而对甲基化 的序列没有结合活性,不能切割。然后经电泳、杂交、PCR等方法检测酶 切结果。可以检测某个基因或DNA序列的甲基化状态,也可用于整个基因 组甲基化状态的筛查。 (1)限制性路标基因组扫描( restriction landmark genome scanning,RLGS) (2)差异性甲基化杂交分析( differential methylation hybridization for methylation analysis, DMH
1. 甲基化敏感的限制性内切酶(MSRE)法 methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE是一类 对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶，它们的识别位点中 含有CpG双核苷酸序列，往往只能结合非甲基化的识别序列，而对甲基化 的序列没有结合活性，不能切割。然后经电泳、杂交、PCR等方法检测酶 切结果。可以检测某个基因或DNA序列的甲基化状态，也可用于整个基因 组甲基化状态的筛查。 （1）限制性路标基因组扫描（restriction landmark genome scanning, RLGS） （2）差异性甲基化杂交分析（differential methylation hybridization for methylation analysis, DMH ）
差式甲基化杂交(DMH) 差异甲基化杂交(DMH,首先是1999年由 Huang等提出的,包 括CpG岛微阵列的制备、标记靶序列的制备以及扫描图谱的分析。 可选择性PR扩增和双色荧光标记肿瘤细胞与正常细胞的甲基化CpG岛, 根据其混合物与吣pG岛微阵列杂交后荧光信号的变化而获得肿瘤细胞 GpG岛甲基化谱。 DMH的优点在于能够在整个基因组范围检测甲基化的发生模式, 高度实现了微阵列技术的高通量优势。缺陷在于只能局限于酶切位点 的甲基化发生情况,遗漏了很多信息,而且由于是整个基因组范围内 的杂交,假阳性的几率较大
差式甲基化杂交（DMH） 差异甲基化杂交(DMH) ,首先是 1999 年由 Huang等提出的 ,包 括 CpG岛微阵列的制备、标记靶序列的制备以及扫描图谱的分析。 可选择性PCR扩增和双色荧光标记肿瘤细胞与正常细胞的甲基化CpG岛， 根据其混合物与CpG岛微阵列杂交后荧光信号的变化而获得肿瘤细胞 CpG岛甲基化谱。 DMH的优点在于能够在整个基因组范围检测甲基化的发生模式 , 高度实现了微阵列技术的高通量优势。缺陷在于只能局限于酶切位点 的甲基化发生情况 ,遗漏了很多信息 ,而且由于是整个基因组范围内 的杂交 ,假阳性的几率较大
e Microarray-based Epigenetic Profiling Unmethylated fraction Sample Control限制性內切酶和PCR的方法 methylation-sensitve restriction enzymes 甲基化敏感限制性内切酶切割 CpG specific Adaptor-Uioat GpG特异适配子连接 CpG specifi MerC GpG特异甲基化不敏感的内切酶 MMM NMa 净净 适配子特异的PQR扩增, 带上不同颜色的荧光标记 Unmethylated fraction + cys 与0pG岛芯片杂交 Analysis Quantiation
Microarray-based Epigenetic Profiling 限制性内切酶和PCR的方法 甲基化敏感限制性内切酶切割 CpG特异适配子连接 CpG特异甲基化不敏感的内切酶 适配子特异的PCR扩增， 带上不同颜色的荧光标记 与CpG岛芯片杂交
Hypomethylation 出 Same methylation Hypermethylation 红色:低甲基化 绿色:高甲基化 黄色:甲基化水平相等 销地 时德 Human CpG island microarray
红色：低甲基化 绿色：高甲基化 黄色：甲基化水平相等
2.高效液相色谱(HPLC法 将DNA用酸或酶裂解为碱基,通过色谱柱分离出各种 碱基,由波长254m的紫外光测定其吸收峰并定量, 灵敏度为碱基。由积分面积5mC/(5mC+0)的百分数 检测基因组DNA中5m0的含量,即DNA甲基化的水平。 此法是目前测定基因组DNA中5mC总量最标准的方法。 但不能对甲基化的位点进行定位
2. 高效液相色谱(HPLC) 法 将DNA用酸或酶裂解为碱基 ,通过色谱柱分离出各种 碱基 ,由波长254nm的紫外光测定其吸收峰并定量 , 灵敏度为碱基。由积分面积 5mC/(5mC+C)的百分数 检测基因组DNA中5mC的含量 ,即DNA甲基化的水平。 此法是目前测定基因组DNA中5mC总量最标准的方法。 但不能对甲基化的位点进行定位
垂/3.免疫化学法 基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反 应的原理。应用荧光素标记抗体与预先固定在 DEAE膜上的DNA特异结合,对膜上荧光进行扫 描,得到5m的水平,此方法较为灵敏,但需 要精密仪器
3. 免疫化学法 基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反 应的原理。应用荧光素标记抗体与预先固定在 DEAE膜上的DNA特异结合，对膜上荧光进行扫 描，得到5mC的水平，此方法较为灵敏，但需 要精密仪器