实验二重组DNA的 提取及酶切鉴定 复旦大学上海医学院 医学实验教学中心
一、实验目的 掌握以下方法和技术: 1.质粒DNA的小量快速制备 2.质粒DNA的限制性内切酶酶切 3.DA的琼脂糖凝胶电泳
二、实验原理 1.质粒DNA的小量快速制备 分离质粒DNA有三个步骤: 1.培养细菌使质粒扩增 2.收集和裂解细菌(本实验:SDS裂解) 3分离和纯化质粒DNA(本实验:碱变性法)
碱变性法抽提质粒DNA Solution II Solution III 离心后去向 pH126 pH4.8 染色体DNA键断裂,双螺、不能复性 旋解开 沉淀中 氢键部分断裂, 质粒 DNA cccDNA互补链复性 上清中 不完全分离
2.质粒DNA的限制性内切酶酶切 1,4kb EcoR I ECoR I+ClaI双酶切(酶切完全时) c-myc-pBR322 5.7kb 琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带 43 kb pBr32质粒载体片段 4.3kb 14kbc-myc目的基因片段
3.琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖——海藻中提取的线状高聚物 加热融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝胶
表51不同类型琼脂箱的操质 脂糖类 凝结温度/t 熔化温度/℃ 商品名 标准盟能 low EEO 35~38 95 aaKem LE (Bo Whittaker) 从 Gelidium app分离 Agote LE (USB) Low EEO Agrose ( Molecuar Boozy Certified Grade 标准意射糖 low EEO SeaKem hot【 Biowhittaker) 从 gracilaria分 Arose HG 高强度麻脂糖 Faslane(Bio Whittaker) Seakem Gold (BioWhittaker) 修饰的低熔点/凝点球脂糖 低焙点 63-65 ScaPlnque(Bowhittrker) 35 超低熔点 g~15 0-45 SaaPrep(Bio whituazar 低性低熔点琼脂蒂 25~30 InCert (Biowhittaker) 85 NuSieve 3: 1(Biowhittaker) 7 30 75 grose HS(Bo Whittaker)
DNA在凝胶中的迁移率的影响因素 DNA分子的大小 琼脂糖的浓度 DNA的构象 所加电压 嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成及其离子强度
TBE, 0.5 ↓泳IVkm,16h 0.7% 09% 12% 14% 23456 迁移距高/cm 9 图52DNA大小和它的电泳迁移率的相关性
不同含量标准的琼脂糖凝胶的分离范围 琼脂糖凝胶浓度线状 DNA分子分离范围 m/v (kb) 0.3 5~60 0. 1~30 0.6 1~20 0.7 0.8~12 1.0 0.5~10 1.2 0.4~6 1.5 0.2~4 2.0 0.1~3 10
