实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点 、实验目的 了解等电聚焦的原理。通过蛋白质等电点的测定,掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等 电聚焦电泳技术 二、实验原理 等电聚焦( Isoelectric focusing,简称IEF)是六十年代中期出现的新技术。近年来 等电聚焦技术有了新的进展,已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电 聚焦技术已可以分辨等电点(p)只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高,重 复性好,样品容量大,操作简便迅速,在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到 广泛的应用 蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负 电荷的阴离子,向电场的正极泳动,在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳 离子,向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中,即蛋白质所带 的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中,对各种不同等电点的蛋白 质混合样品进行电泳,则在电场作用下,不管这些蛋白质分子的原始分布如何,各种蛋 白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦,经过 定时间的电泳以后,不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。这种按等电 点的大小,生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。 等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的 pH梯度,使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦,从而达到分离、测定 和鉴定的目的 两性电解质载体,实际上是许多异构和同系物的混合物,它们是一系列多羧基多氨 基脂肪族化合物,分子量在300~1000之间。常用的进口两性电解质为瑞典 Pharmacia-LKB公司生产的 Ampholine和 Pharmalyte,价格昂贵。国产的有中国军事医 学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质,价格便宜,质量尚佳。两性 电解质在直流电场的作用下,能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的 pH梯度。若不同的pH值的两性电解质的含量与pl值的分布越均匀,则pH梯度的线性 就越好。对 Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强,有良好的导电性,分子量要小 不干扰被分析的样品等 在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后,如保持pl梯度的稳定是极为重要的。 为了防止扩散,稳定pH梯度,就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质,最常用的这 种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时,凝胶柱内即 产生pH梯度,当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位,而此部位的pH值正好等于该 蛋白质的等电点时,该蛋白质即聚焦形成一条区带,只要测出此区带所处部位的pH值 即为其等电点。电泳时间越长,蛋白质聚焦的区带就越集中,越狭窄,因而提高了分辨 率。这是等电聚焦的一大优点,不像一般的其他电泳,电泳时间过长则区带扩散。所以 等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点,而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分184 实验三 等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点 一、实验目的 了解等电聚焦的原理。通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等 电聚焦电泳技术。 二、实验原理 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称 IEF）是六十年代中期出现的新技术。近年来 等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电 聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差 0.001pH 单位的生物分子。由于其分辨力高，重 复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到 广泛的应用。 蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的 pH 环境中解离成带负 电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的 pH 环境中解离成带正由荷的阳 离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的 pH 环境中，即蛋白质所带 的净电荷为零时才能停止。如果在一个有 pH 梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白 质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋 白质分子将按照它们各自的等电点大小在 pH 梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一 定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置 。这种按等电 点的大小，生物分子在 pH 梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。 等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的 pH 梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定 和鉴定的目的。 两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨 基脂肪 族化合 物，分 子量 在 300~1000 之间 。常 用的进 口两性 电解 质为瑞典 Pharmacia-LKB 公司生产的 Ampholine 和 Pharmalyte，价格昂贵。国产的有中国军事医 学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。两性 电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的 pH 值逐渐升高的平滑连续的 pH 梯度。若不同的 pH 值的两性电解质的含量与 pI 值的分布越均匀，则 pH 梯度的线性 就越好。对 Ampholine 两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小， 不干扰被分析的样品等。 在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持 pH 梯度的稳定是极为重要的。 为了防止扩散，稳定 pH 梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这 种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即 产生 pH 梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的 pH 值正好等于该 蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的 pH 值， 即为其等电点。电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨 率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。所以 等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分