剂,然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子,这时绝大部分对配 基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留,只有与配基互补的化合物被吸附 留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后,再改变洗脱条件,使结合在配基上的物质解离 下来。这样,原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。其过程 可用简图表示如下 亲和层析原理示意图 本实验为了纯化胰蛋白酶,采用胰蛋白酶的天然抑制剂一鸡卵粘蛋白作为配基制成 亲和吸附剂,从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑 制剂,对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用,但不抑制糜蛋白酶。在pH=7-8的缓 冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合,而在pH=2~3时,又能被解离下来 因此,采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直 接获得活力大于10,000BAEE单位/毫克蛋白胰蛋白酶制品,比用经典分离纯化方法简 便得多。纯化效率可达到10~20倍以上。 四、试剂与器材 主要试剂:丙酮三氯乙酸HC1 Naoh NaCI NaHCO3NaCO3氯代环氧丙 烷乙腈甲酸 Tris CaCI2 KCI DEAE-纤维素 Sepharose-4B.新鲜猪胰脏 鸡蛋清乙酸二氧六环二甲基亚砜 主要贮存溶液: 1.鸡卵粘蛋白层析液(1升)002 mol/LpH=7.3 Tris-HCI Buffer 2.DEAE纤维素处理液:0.5 MOl/L HCI300m和0.5 mol/L Naoh-0.5mo/ L NaCl 0.3升。 3.卵粘蛋白洗脱液:0.02mol/LpH=7.3 Tris-HCI Buffer含0.3 mo/L NaCl,150ml 4.标准胰蛋白酶溶液:结晶胰蛋白酶以0.001NHC配制成50μug/ml。 5.亲和层析柱平衡液:01 mol/L pH=8.0 Tris -HCl Buffer,含0.5mol/KCl248 剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配 基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附 留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离 下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。其过程 可用简图表示如下： 亲和层析原理示意图 本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成 亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑 制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在 pH = 7~8 的缓 冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在 pH =2~3 时，又能被解离下来。 因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直 接获得活力大于 10,000 BAEE 单位/ 毫克蛋白 胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简 便得多。纯化效率可达到 10 ~ 20 倍以上。 四、试剂与器材 主要试剂：丙酮 三氯乙酸 HCl NaOH NaCl NaHCO3 Na2CO3 氯代环氧丙 烷 乙腈 甲酸 Tris CaCl2 KCl DEAE-纤维素 Sepharose-4B. 新鲜猪胰脏 鸡蛋清 乙酸 二氧六环 二甲基亚砜 主要贮存溶液： 1. 鸡卵粘蛋白层析液（1 升）0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer。 2. DEAE-纤维素处理液：0.5 mol/L HCl 300ml 和 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.3 升。 3. 卵粘蛋白洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer 含 0.3mol/L NaCl, 150ml. 4. 标准胰蛋白酶溶液：结晶胰蛋白酶以 0.001N HCl 配制成 50g/ml。 5. 亲和层析柱平衡液：0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl Buffer ,含 0.5mol/LKCl