0.05mol/L CaCl2, 500mlo(At 1000ml: 12 1g Tris, 375g KCl, 5.6g Cacl). 6.005 mol/L pH=80 Tris-HCl Buffer含02%Cacl2(全斑公用,配100ml:605g ris水溶后,先用4 mol/L HCI调pH为8.0,然后方可加2 g Caclz) 7.亲和柱解吸液:0. I mol/ L甲酸-0.5 mol/L KCI pH=2.5,500ml。(配1000ml:375g KCl,4.35m甲酸)。 8. Sepharose4B胶清洗液:0.5 mol/L NaCl和0. I mol/L Nahco3缓冲液pH=9.5,各 500ml 9BAEE底物缓冲液:34 mg Baee溶于50ml005mol/LpH=80 Tris-HCl buffer 中,临用前配制,冰箱内可保存3天 主要器材: 恒温水浴,温度计,G2玻璃漏斗,抽滤瓶,布氏漏斗,离心杯(50m),透析袋 层析柱(2×30cm,26×30cm),秒表,移液管,贮液瓶(1升),电磁搅拌器,pH计,紫 外分光光度计,纱布,匀浆器,pH试纸。 五、实验操作步骤 (一)鸡卵粘蛋白的分离及纯化 1.鸡卵粘蛋白( Ovomucoid)的一些性质: Ovomucoid是一种糖蛋白,在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脲、有机溶剂, 均有较高的耐受性。但在较酸、碱条件下,易引起变性。 Ovomucoid带有四种糖基,因 此有较强的吸水性。在50%丙酮或5%三氯乙酸盐的水溶液中,仍有较好的溶解度。所以, 选择合适的pH,丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度,可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白 由于 Ovomucoid所带的糖基不同,电泳行为呈现出不均一性,等电点在39~45 之间并呈现出四条电泳条带,但它们在生物学功能上差异不大,在氨基酸组成上几乎无 差异,分子量约为28,000。每1摩尔的卵粘蛋白分子能抑制1摩尔的胰蛋白酶。所以每 毫克高纯度的卵粘蛋白能抑制约0.84毫克的胰蛋白酶。 Ovomucoid在280m处的百分 消光系数A%1cm280=4.13.,即蛋白酶浓度为lmg/ml时,溶液的吸光度A280=0.413,据 此可以测定其溶液中蛋白质的含量 2. Ovomucoid的分离及粗品制备: 取2只鸡蛋,得蛋清约50ml,将其温热至25℃左右,加入等体积10%pH=10的 三氯乙酸溶液(配制三氯乙酸:称取10克三氯乙酸,用70ml蒸馏水溶解,再用5moⅥL NaOH调pl=1.0左右,最后加蒸馏水至10ml。),这时出现大量白色沉淀,充分搅匀 后,测定溶液的pH值,此时溶液的pH值应当是3.5±02,若偏离此值,用 5N HCI或5moL NaOH溶液调pH=35±0,2,注意在调pH值时,要严防局部过酸或过碱。接着25℃放 置4小时或过夜。次日用4000~6000转分离心20分钟,收集清液,再用三层纱布过滤 并检查滤液的pH值是否仍为3.5±0.2,若不是,则要调回到此范围内。然后将清液放冰 浴冷却至o℃,缓缓加入3倍体积预先冷却的丙酮,用玻璃棒搅拌均匀并用塑料薄膜盖好 防止丙酮挥发,放冰箱或冰浴中3~4小时后,离心(3000转/分,15~20分钟)收集 沉淀(清液留待回收丙酮)。将沉淀抽真空去净丙酮,得到粗的卵粘蛋白。将其用20ml 左右蒸馏水溶解。若溶解后的溶液浑浊,可用滤纸过滤或离心去掉不溶物。取上清装透249 0.05mol/L CaCl2, 500ml。（配 1000ml：12.1g Tris，37.5g KCl，5.6g Cacl2）。 6. 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer 含 0.2% Cacl2（全斑公用，配 1000ml：6.05g Tris 水溶后，先用 4mol/L HCl 调 pH 为 8.0，然后方可加 2g Cacl2 ）。 7. 亲和柱解吸液：0.1mol/L 甲酸—0.5 mol/L KCl pH = 2.5 , 500ml。（配 1000ml：37.5g KCl，4.35ml 甲酸）。 8. Sepharose 4B 胶清洗液：0.5mol/L NaCl 和 0.1mol/L NaHCO3 缓冲液，pH = 9.5, 各 500ml. 9. BAEE 底物缓冲液：34mg BAEE 溶于 50ml 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris -HCl buffer 中，临用前配制，冰箱内可保存 3 天。 主要器材： 恒温水浴，温度计，G2 玻璃漏斗，抽滤瓶，布氏漏斗，离心杯（50ml），透析袋， 层析柱（2×30cm,26×30cm），秒表，移液管，贮液瓶（1 升），电磁搅拌器，pH 计，紫 外分光光度计，纱布，匀浆器，pH 试纸。 五、实验操作步骤 （一）鸡卵粘蛋白的分离及纯化 1. 鸡卵粘蛋白（Ovomucoid）的一些性质: Ovomucoid 是一种糖蛋白，在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脲、有机溶剂， 均有较高的耐受性。但在较酸、碱条件下，易引起变性。 Ovomucoid 带有四种糖基，因 此有较强的吸水性。在 50%丙酮或 5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。所以， 选择合适的 pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。 由于 Ovomucoid 所带的糖基不同，电泳行为呈现出不均一性，等电点在 3.9 ~ 4.5 之间并呈现出四条电泳条带，但它们在生物学功能上差异不大，在氨基酸组成上几乎无 差异，分子量约为 28,000。每 1 摩尔的卵粘蛋白分子能抑制 1 摩尔的胰蛋白酶。所以每 毫克高纯度的卵粘蛋白能抑制约 0.84 毫克的胰蛋白酶。Ovomucoid 在 280nm 处的百分 消光系数 A1%1cm.280 = 4.13. ， 即蛋白酶浓度为 1mg/ml 时,溶液的吸光度 A280 = 0.413 ，据 此可以测定其溶液中蛋白质的含量。 2. Ovomucoid 的分离及粗品制备： 取 2 只鸡蛋，得蛋清约 50 ml ，将其温热至 25℃左右，加入等体积 10 % pH = 1.0 的 三氯乙酸溶液（配制三氯乙酸：称取 10 克三氯乙酸，用 70 ml 蒸馏水溶解，再用 5mol/L NaOH 调 pH = 1.0 左右，最后加蒸馏水至 100ml。），这时出现大量白色沉淀，充分搅匀 后，测定溶液的 pH 值，此时溶液的 pH 值应当是 3.5±0.2 ,若偏离此值，用 5N HCl 或 5mol/L NaOH 溶液调 pH = 3.5±0.2 ，注意在调 pH 值时，要严防局部过酸或过碱。接着 25℃放 置 4 小时或过夜。次日用 4000~6000 转/分 离心 20 分钟，收集清液，再用三层纱布过滤 并检查滤液的 pH 值是否仍为 3.5±0.2，若不是，则要调回到此范围内。然后将清液放冰 浴冷却至 0℃，缓缓加入 3 倍体积预先冷却的丙酮，用玻璃棒搅拌均匀并用塑料薄膜盖好 防止丙酮挥发，放冰箱或冰浴中 3 ~ 4 小时后，离心（ 3000 转/ 分，15 ~ 20 分钟）收集 沉淀（清液留待回收丙酮）。将沉淀抽真空去净丙酮，得到粗的卵粘蛋白。将其用 20 ml 左右蒸馏水溶解。若溶解后的溶液浑浊，可用滤纸过滤或离心去掉不溶物。取上清装透