析袋,并对蒸馏水透析去除三氯乙酸(或用 Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐去除三氯乙 酸)。测定其抑制胰蛋白酶的比活力。若比活力大于7000BAEE/mg,可直接用作亲和 配基制备亲和吸附剂,否则应进一步纯化。 3 Ovomucoid的纯化 DEAE-纤维素的处理:称取10克DEAE- Cellulose粉(DE-32),先用约150ml 0.5 mol/L Nacl—0.5 mol/L Naoh溶液溶胀30分钟,用G2漏斗抽干并用去离子水冲洗至 中性,转入烧杯中再用约150ml0.5 molL HCl浸泡20分钟,再在G2漏斗中用蒸馏水洗 至中性,最后用约150m002 mol/L pH=73 Tris-HCI缓冲液浸泡,抽真空去气泡后装柱 (2cm×20cm柱),并用同一缓冲液平衡一个床体积即可使用 将粗的 Ovomucoid制品加入等体积的002 mol/L pH=7.3 Tris-HCI绥冲液后上柱吸附 并用同一缓冲液洗杂蛋白至A280005为止。最后用含03 mol/L NaCl的上述Tris-Hq缓 冲液洗脱。收集具有胰蛋白酶抑制活性的蛋白峰。测定合并液的蛋白含量及卵粘蛋白的 比活性及总活力 最后将其对蒸馏水透析(或用 Sephadex G-25)脱盐,精确调溶液pH=4-0~4.5,加 入3倍体积予冷的丙酮沉淀,放冰箱或冰浴3~4小时,然后离心(3000转/分,15~20 分钟)收集沉淀(清液回收丙酮),真空下抽去丙酮即得卵粘蛋白干粉。如将透析后溶液 吹风浓缩,冰冻干燥则得海绵状松软白色干粉的卵粘蛋白 鸡卵粘蛋白粗提物在DEAE- Cellulose柱上的层析图 平衡缓冲液:0.02 mol pH=73 Tris-HCI缓冲液 冲洗缓冲液:同上 洗脱液:0.02 mol/L pH=73Tris-HCl缓冲液并含0.3 mol/ NaCl (二)亲和吸附剂的合成 目前有多种方法活化载体和偶联配基制备亲和吸附剂。本实验采用氯代环氧丙烷活 化载体与偶联配基(在附录中注明了溴化氰活化载体与偶联配基的方法)。 1.载体 Sepharose4B的活化-氯代环氧丙烷活化可用下面两种溶剂。 (1)二氧六环250 析袋，并对蒸馏水透析去除三氯乙酸（或用 Sephadex G - 25 凝胶层析柱脱盐去除三氯乙 酸）。测定其抑制胰蛋白酶的比活力。若比活力大于 7000 BAEE / mg ，可直接用作亲和 配基制备亲和吸附剂，否则应进一步纯化。 3. Ovomucoid 的纯化 DEAE-纤维素的处理：称取 10 克 DEAE - Cellulose 粉（DE - 32），先用约 150 ml 0.5mol/L NaCl ⎯ 0.5mol/L NaOH 溶液溶胀 30 分钟，用 G2 漏斗抽干并用去离子水冲洗至 中性，转入烧杯中再用约 150ml 0.5mol/L HCl 浸泡 20 分钟，再在 G2 漏斗中用蒸馏水洗 至中性，最后用约 150 ml 0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl 缓冲液浸泡，抽真空去气泡后装柱 （2cm×20cm 柱），并用同一缓冲液平衡一个床体积即可使用。 将粗的 Ovomucoid 制品加入等体积的 0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl 绥冲液后上柱吸附， 并用同一缓冲液洗杂蛋白至 A280<0.05 为止。最后用含 0.3mol/L NaCl 的上述 Tris - HCl 缓 冲液洗脱。收集具有胰蛋白酶抑制活性的蛋白峰。测定合并液的蛋白含量及卵粘蛋白的 比活性及总活力。 最后将其对蒸馏水透析（或用 Sephadex G-25）脱盐，精确调溶液 pH = 4.0 ~ 4.5，加 入 3 倍体积予冷的丙酮沉淀，放冰箱或冰浴 3 ~ 4 小时，然后离心（3000 转/ 分，15 ~ 20 分钟）收集沉淀（清液回收丙酮），真空下抽去丙酮即得卵粘蛋白干粉。如将透析后溶液 吹风浓缩，冰冻干燥则得海绵状松软白色干粉的卵粘蛋白。 鸡卵粘蛋白粗提物在 DEAE-Cellulose 柱上的层析图 平衡缓冲液：0.02mol/L pH =7.3 Tris-HCl 缓冲液 冲洗缓冲液：同上 洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris- HCl 缓冲液并含 0.3mol/L NaCl （二）亲和吸附剂的合成 目前有多种方法活化载体和偶联配基制备亲和吸附剂。本实验采用氯代环氧丙烷活 化载体与偶联配基（在附录中注明了溴化氰活化载体与偶联配基的方法）。 1. 载体 Sepharose 4B 的活化 - 氯代环氧丙烷活化. 可用下面两种溶剂。 (1) 二氧六环