取loml沉淀体积的 Sepharose4B于G2玻璃烧结漏斗中,抽滤成半干,先用约 l00ml.0.5 mol/L NaCl溶液淋洗,再用100-150ml蒸馏水洗涤,以除去其中的保护剂和防 腐剂。抽干约得6克半干滤并,置于50ml三角瓶中,加入6.5ml2mol/ L NaOh,2ml氯 代环氧丙烷及l5m56%二氧六环,并置于40℃温和搅拌2小时,然后将胶转移到G玻 璃漏斗中以蒸馏水淋洗除去多余的试剂,最后再用约100m0.2moJ/ L Na2CO3 ph=9.5 缓冲液洗涤。接着尽快进行偶联实验。 (2)二甲基亚砜 同(1)法将6克半干滤并置于50ml三角瓶中,加入6.5ml2mo/ L Naoh,2ml 氯代环氧丙烷及15ml56%二甲基亚砜,充分混匀,在40℃振荡2小时,然后同(1)法 洗涤凝胶后尽快进行偶联。 2.鸡卵粘蛋白与活化的载体 Sepharose-4B偶联 将已活化好的 Sepharose-4B转移到三角瓶中。用10m0.2mol/ L Naco3,p=9.5 缓冲液将上述制备好的卵粘蛋白溶解(或0.1 mol/L NaoH1oml溶解),取出0.lm溶液稀 释20~30倍,用紫外分光光度计测定卵粘蛋白的含量。剩余的溶液全部转移到三角瓶中 与活化好的 Sepharose4B偶联。在40℃恒温摇床振荡24小时左右。偶联终止后,将凝胶 倒入G2漏斗中抽干并用10on0.5 mol/L Nacl溶液洗去未偶联上的蛋白(收集滤液,测 蛋白含量及总活力,以计算偶联率),再用100ml蒸馏水淋洗。接着用亲和洗脱液 (0. Imol/L甲酸—0.5 moVL KCI pH=2.5)50ml洗一次。最后用蒸馏水洗至中性,浸 泡于亲和柱平衡液005 mol/L cacl20.lmo/LpH=80Tris-HCl缓冲液中,放冰箱待用 环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联反应式如下: (三)亲和层析分离纯化胰蛋白酶 1.粗胰蛋白藤的制备 取00g新鲜冰冻猪胰脏,剥去脂肪及结缔组织后在匀浆机器中搅碎,加入约200ml, 预冷的乙酸酸化水(pH=40),8-10℃条件下,搅拌提取45小时,然后四层纱布挤滤 (残渣再用约l00m乙酸酸化水搅拌提取1小时,四层纱布挤滤),收集合并两次滤液 用2.5mo/LHSO调pH=2.5.~3.0,放置1~2小时(静置期间要检査一下pH值,应始终 保持pH=2.5~30),最后用滤纸过滤,收集滤液待激活251 取 10ml 沉淀体积的 Sepharose 4B 于 G2 玻璃烧结漏斗中，抽滤成半干，先用约 100 ml. 0.5mol/L NaCl 溶液淋洗，再用 100~150ml 蒸馏水洗涤，以除去其中的保护剂和防 腐剂。抽干约得 6 克半干滤并，置于 50ml 三角瓶中，加入 6.5 ml 2mol/L NaOH，2ml 氯 代环氧丙烷及 15ml 56%二氧六环，并置于 40℃温和搅拌 2 小时，然后将胶转移到 G2 玻 璃漏斗中以蒸馏水淋洗除去多余的试剂，最后再用约 100ml 0.2mol/L Na2CO3 pH = 9.5 缓冲液洗涤。接着尽快进行偶联实验。 （2）二甲基亚砜 同（1）法将 6 克半干滤并置于 50ml 三角瓶中，加入 6.5 ml 2mol/L NaOH，2 ml 氯代环氧丙烷及 15ml 56%二甲基亚砜，充分混匀，在 40℃ 振荡 2 小时，然后同（1）法 洗涤凝胶后尽快进行偶联。 2. 鸡卵粘蛋白与活化的载体 Sepharose-4B 偶联 将已活化好的 Sepharose-4B 转移到三角瓶中。用 10ml 0.2mol/L Na2CO3, pH = 9.5 缓冲液将上述制备好的卵粘蛋白溶解（或 0.1mol/L NaOH 10ml 溶解），取出 0.1ml 溶液稀 释 20 ~ 30 倍，用紫外分光光度计测定卵粘蛋白的含量。剩余的溶液全部转移到三角瓶中 与活化好的 Sepharose 4B 偶联。在 40℃恒温摇床振荡 24 小时左右。偶联终止后，将凝胶 倒入 G2 漏斗中抽干并用 100ml 0.5mol/L NaCl 溶液洗去未偶联上的蛋白（收集滤液，测 蛋白含量及总活力，以计算偶联率）, 再用 100ml 蒸馏水淋洗。接着用亲和洗脱液 （ 0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L KCl pH = 2.5）50ml 洗一次。最后用蒸馏水洗至中性，浸 泡于亲和柱平衡液 0.05 mol/L CaCl2 0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl 缓冲液中，放冰箱待用。 环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联反应式如下： （三）亲和层析分离纯化胰蛋白酶 1. 粗胰蛋白酶的制备 取 100g 新鲜冰冻猪胰脏，剥去脂肪及结缔组织后在匀浆机器中搅碎，加入约 200ml, 预冷的乙酸酸化水（pH = 4.0）, 8~10℃条件下, 搅拌提取 4~5 小时 ，然后四层纱布挤滤 （残渣再用约 100ml 乙酸酸化水搅拌提取 1 小时，四层纱布挤滤），收集合并两次滤液， 用 2.5mol/L H2SO4调 pH = 2.5.~3.0，放置 1~2 小时（静置期间要检查一下 pH 值，应始终 保持 pH = 2.5~3.0）,最后用滤纸过滤，收集滤液待激活