2.胰蛋白酶原的激活: 将滤液用5 mol/L NaOH调pH=8.0,加固体CaCh2,使溶液中Ca2的终浓度达到 0.1mo/L。(注意先取2ml胰蛋白酶粗提液测定激活前的蛋白含量及酶活性。)然后加入2 5mg结晶胰蛋白酶进行激活,于5℃冰箱放置18-20小时进行激活(或在室温下,20 25℃左右激活2~4小时)即可完成。激活期间,分别在16、18小时取样测酶的活性, 待酶的比活达到800~1000BAEE单位/mg时停止激活。用25 mol/L H2SO4调至pH=2 3.0,滤去CaSO4沉淀物,滤液放冰箱内备用。 3.亲和层析纯化胰蛋白醇 (1)装柱:取一支层析柱,先装入14体积的亲和柱平衡液(0.1mo/LpH=8.0 含0.05 mol/L CaCI2的Tris-HCl溶液)。然后将亲和吸附剂轻轻搅匀,缓缓加入柱内,待 其自然沉降,调好流速3ml/ 10 min左右用亲和柱平衡液平衡,检测流出液A28值小于 0.02 (2)上样:将胰蛋白酶粗提液用5 mol/L NaoH调至p=80,(若有沉淀,过滤去 除之)。取一定体积上述澄清溶液上柱吸附。上样体积可大致计算如下: 胰蛋白酶上样体积(ml) W×0.84×1.3×10 1.5 式中:W:是卵粘蛋白偶联的总mg数; 0.84:是1mg卵粘蛋白能抑制约084mg胰蛋白酶 3×104:是纯化后胰蛋白酶比活的近似值 C:是胰蛋白酶粗提液的浓度(mgm1) A:是胰蛋白酶粗提液的比活( bAEE/mg) 15:是上样量过量50% 吸附毕,先用平衡液洗涤,至流出液A28<0.02。换洗脱液洗脱。 (3)洗脱及收集胰蛋白藤:用0moL甲酸—05 mol/L KCl pH=25洗脱液进行 洗脱。洗脱速度约2~4ml/l0min然后收集蛋白峰并测定收集液的蛋白含量、酶的比活 力及总活力 亲和层析柱用平衡缓冲液平衡后可再次作亲和层析。若柱内加入防腐剂0.01%叠氮 化钠NaN3在冰箱中保存,至少一年内活性不丧失 最后可用两种方法将纯化的胰蛋白酶制成固体保存: (1)将比活力最高部分用固体(NH2SO4以0.8饱和度盐析,放置4小时以上,抽滤 收集硫酸铵沉淀(要抽干)。滤并先用少量蒸馏水溶解,再加入14体积0.8 mol/L pH=90 的硼酸溶液,冰箱中放置,数日后即可获得棒状结晶。(注:只有胰蛋白酶的量较多时, 才能得到结晶品) (2)将亲和层析获得的胰蛋白酶溶液放入透析袋內,在4℃对蒸馏水透析,然后冷冻 干燥成干粉252 2. 胰蛋白酶原的激活： 将滤液用 5mol/L NaOH 调 pH = 8.0，加固体 CaCl2 ，使溶液中 Ca² +的终浓度达到 0.1mol/L。( 注意先取 2ml 胰蛋白酶粗提液测定激活前的蛋白含量及酶活性。)然后加入 2 ~5mg 结晶胰蛋白酶进行激活 ，于 5℃冰箱放置 18~20 小时进行激活（或在室温下，20 ~ 25℃左右激活 2 ~ 4 小时）即可完成。激活期间，分别在 16、18 小时取样测酶的活性， 待酶的比活达到 800 ~ 1000 BAEE 单位/ mg 时停止激活。用 2.5mol/L H2SO4 调至 pH = 2.5 ~ 3.0, 滤去 CaSO4 沉淀物，滤液放冰箱内备用。 3. 亲和层析纯化胰蛋白酶： （1） 装柱：取一支层析柱，先装入 1/4 体积的亲和柱平衡液（0.1mol/L pH = 8.0, 含 0.05mol/L CaCl2 的 Tris - HCl 溶液）。然后将亲和吸附剂轻轻搅匀，缓缓加入柱内，待 其自然沉降，调好流速 3ml / 10 min 左右,用亲和柱平衡液平衡，检测流出液 A280 值小于 0.02 . （2）上样：将胰蛋白酶粗提液用 5mol/L NaOH 调至 pH = 8.0,（若有沉淀，过滤去 除之）。取一定体积上述澄清溶液上柱吸附。上样体积可大致计算如下： 胰蛋白酶上样体积（ml）= 1.5 0.84 1.3 104      C A W 式中： W：是卵粘蛋白偶联的总 mg 数； 0.84：是 1mg 卵粘蛋白能抑制约 0.84mg 胰蛋白酶； 3×104 ：是纯化后胰蛋白酶比活的近似值； C：是胰蛋白酶粗提液的浓度（mg/ml）； A：是胰蛋白酶粗提液的比活（BAEE/mg）； 1.5：是上样量过量 50% 。 吸附毕，先用平衡液洗涤，至流出液 A280<0.02。换洗脱液洗脱。 （3）洗脱及收集胰蛋白酶：用 0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L KCl pH = 2.5 洗脱液进行 洗脱。洗脱速度约 2 ~ 4ml / 10min. 然后收集蛋白峰并测定收集液的蛋白含量、酶的比活 力及总活力。 亲和层析柱用平衡缓冲液平衡后可再次作亲和层析。若柱内加入防腐剂 0.01% 叠氮 化钠 NaN3 在冰箱中保存，至少一年内活性不丧失。 最后可用两种方法将纯化的胰蛋白酶制成固体保存： （1）将比活力最高部分用固体(NH4)2SO4 以 0.8 饱和度盐析，放置 4 小时以上，抽滤 收集硫酸铵沉淀（要抽干）。滤并先用少量蒸馏水溶解，再加入 1/4 体积 0.8mol/L pH = 9.0 的硼酸溶液，冰箱中放置, 数日后即可获得棒状结晶。（注：只有胰蛋白酶的量较多时， 才能得到结晶品）。 （2）将亲和层析获得的胰蛋白酶溶液放入透析袋內，在 4℃对蒸馏水透析，然后冷冻 干燥成干粉