宠物饲料样品（农业部饲料供应中心提供），甲醇、乙腈为北京艾杰尔科技有限公司提供：氨水、乙 酸铅、三氯乙酸、均购于北京化学试剂公司：三聚氰胺标准品、柠檬酸、辛烷磺酸钠(Sgma公司)，甲醇 为色谱纯，其他均为化学纯。 3实验方法 3.1样品前处理方法 (1)标准样品配制： 取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的标准溶液，使用时，以提 取液(0.1%三氯乙酸)稀释至所要的浓度。 (2)提取： 称取饲料样品5g,加入50ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2mL2%乙酸铅溶液，超声 20min 然后取部分溶液转移至10mL离心管中，8000rpm/min离心10min,取上清液3mL过混合型阳离子 交换小柱PCX。 (3)净化(PCX小柱，60mg3mL): a)活化及平衡：3mL甲醇，3mL水 b)上样：加入提取液3mL c)淋洗：3mL水：3mL甲醇：弃去淋洗液并将小柱抽干。 d)洗脱：5mL5%氨化甲醇(vw)洗脱。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。 e)浓缩：50℃，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2mL,HPLC分析或衍生后GCMS分析。 3.2HPLC检测方法 3.2.1三聚氰胺HPLC-UV检测方法 三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有 良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局(D4)的三聚氰胺检测方法和中国农业部公布的三 聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Ag©la)ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分离效果，分析色谱图 如下： (a)色谱柱：VenusilASBC84.6×250mm标准：FDA方法；流动相：缓冲液：乙腈=85：15；缓冲液： 10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0：流速：1.0mL/min,柱温：40oC:波长：240nm (b)色谱柱：VenusilASB-C184.6×250mm;标准：中国农业部颁标准方法，缓冲液：10mM柠檬 酸，10mM庾烷磺酸钠：流动相：缓冲溶液：乙腈=85：15；流速：1.0mL/min,柱温：40℃，波长：240nm 3.2.2三聚氰胺LC-MS检测方法 由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，因此限制了液质联用方法的使用 但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，不能得到较好的分离定量宠物饲料样品(农业部饲料供应中心提供);甲醇、乙腈为北京艾杰尔科技有限公司提供;氨水、乙 酸铅、三氯乙酸、均购于北京化学试剂公司;三聚氰胺标准品、柠檬酸、辛烷磺酸钠(Sigma公司);甲醇 为色谱纯，其他均为化学纯。 3实验方法 3.1样品前处理方法 (1)标准样品配制： 取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的标准溶液，使用时，以提 取液(0.1%三氯乙酸)稀释至所要的浓度。 (2)提取： 称取饲料样品5g，加入50ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2mL2%乙酸铅溶液，超声 20min。 然后取部分溶液转移至10mL离心管中，8000rpm/min离心10min，取上清液3mL过混合型阳离子 交换小柱(PCX)。 (3)净化(PCX小柱，60mg/3mL)： a)活化及平衡：3mL甲醇，3mL水 b)上样：加入提取液3mL c)淋洗：3mL水;3mL甲醇;弃去淋洗液并将小柱抽干。 d)洗脱：5mL5%氨化甲醇(v/v)洗脱。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。 e)浓缩：50℃，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。 3.2HPLC检测方法 3.2.1三聚氰胺HPLC-UV检测方法 三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有 良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局(FDA)的三聚氰胺检测方法和中国农业部公布的三 聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分离效果，分析色谱图 如下： (a)色谱柱：VenusilASBC84.6×250mm;标准：FDA方法;流动相：缓冲液：乙腈=85：15;缓冲液： 10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0;流速：1.0mL/min;柱温：40oC;波长：240nm (b)色谱柱：VenusilASB-C184.6×250mm;标准：中国农业部颁标准方法;缓冲液：10mM柠檬 酸,10mM庚烷磺酸钠;流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min;柱温：40℃;波长：240nm 3.2.2三聚氰胺LC-MS检测方法 由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，因此限制了液质联用方法的使用; 但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，不能得到较好的分离定量