实验25重组质粒 实验目的 放大某一基因片段,用于探针、基因功能检测、报道基因硏究等。方法是:把某 NA片段插入到相应的载体(比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等),给予扩增, 用以标记探针、测序、cDNA库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒 就成为中医药实验研究中最为常规的实验 通常,扩增目的DNA主要借助两类方法,即PCR技术和载体重组技术,鉴于PCR 技术受到酶的性能和方法学等多方面的限制,某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有 困难,所以载体重组技术倍受青睐 2. DDPCR产物的克隆和测序 3. RACE PCR产物的克隆和测序 4.构建基因库、cDNA库,等 常用的载体主要有质粒、λ噬菌体、粘粒载体等,哺乳类细胞表达载体是一种经改造 的质粒,其中使用最广泛的是质粒 质粒是一类双链、闭环的DNA分子,存在于细菌体中,独立于细菌染色体之外进行 复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造,实验室常用质粒被赋予了以下几种特性: 1.含有多克隆位点区域,可方便地插入目的DNA片段。 2.对细菌的可转移性,即在实验中,可将质粒诱导入细菌 3.选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样,一旦质粒进入细菌,便可使该细菌 对相应的抗生素产生抵抗能力,在含这一抗生素的琼脂平板上传代。 4.在细菌体内可获得较高的拷贝数,例如一种叫pUC的质粒,在单一细菌体中的拷 贝数可达500-700个。因此,质粒已成为分子生物学中使用最为广泛的载体 本实验介绍的质粒全长3000个碱基对(bp),在质粒的10-110bp段为多克隆位点区 域,含有XbaI、 EcoR I、Kpnl、Smal、Hind、 Bamh I、SacI等多种限制性内切酶的位 占 原理 采用由 EcoR I切割开的pGEM7质粒,以及由 EcoR I切割大鼠促性腺激素释放激素 ( gnrH)基因启动子并分离出的-171~-432 gNrH DNA片段,用T4噬菌体DNA连接酶 将GnRH启动子DNA片段与切割开质粒DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子,即 把目的基因(GnRH启动子DNA)插入质粒DNA,实现质粒重组。 实验准备(略) 实验步骤 标记试管(内容、日期),插入碎冰,依次加入: H2O 50ng/ul PGEM-7 DNA 2 ul 171--432 rGnRH DNA 盖上盖,放入45℃水浴×5min,插入冰内,开盖,再加入: 10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 5mM ATP lul Ⅳ4噬菌体DNA连接醯 指拨混匀,用离心机将管壁溶液甩至管底,16℃过夜 实验结果实验 25 重组质粒 实验目的 1．放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某 一 DNA 片段插入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等），给予扩增， 用以标记探针、测序、cDNA 库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒 就成为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常，扩增目的 DNA 主要借助两类方法，即 PCR 技术和载体重组技术，鉴于 PCR 技术受到酶的性能和方法学等多方面的限制，某些 DNA 和超过一定长度 DNA 的扩增会有 困难，所以载体重组技术倍受青睐。 2．DDPCR 产物的克隆和测序。 3．RACE PCR 产物的克隆和测序。 4．构建基因库、cDNA 库，等。 常用的载体主要有质粒、λ 噬菌体、粘粒载体等，哺乳类细胞表达载体是一种经改造 的质粒，其中使用最广泛的是质粒。 质粒是一类双链、闭环的 DNA 分子，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行 复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，实验室常用质粒被赋予了以下几种特性： 1．含有多克隆位点区域，可方便地插入目的 DNA 片段。 2．对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。 3．选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌 对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代。 4．在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫 pUC 的质粒，在单一细菌体中的拷 贝数可达 500-700 个。因此，质粒已成为分子生物学中使用最为广泛的载体。 本实验介绍的质粒全长 3000 个碱基对（bp），在质粒的 10-110 bp 段为多克隆位点区 域，含有 Xba I、EcoR I、Kpn I、Sma I、Hind III、BamH I、Sac I 等多种限制性内切酶的位 点。 原 理 采用由 EcoR I 切割开的 pGEM-7 质粒，以及由 EcoR I 切割大鼠促性腺激素释放激素 （rGnRH）基因启动子并分离出的-171~-432 rGnRH DNA 片段，用 T4 噬菌体 DNA 连接酶 将 GnRH 启动子 DNA 片段与切割开质粒 DNA 片段重新连接成一个环状的 DNA 分子，即 把目的基因（GnRH 启动子 DNA）插入质粒 DNA，实现质粒重组。 实验准备（略） 实验步骤 标记试管（内容、日期），插入碎冰，依次加入： H2O 3 ul 50ng/ul pGEM-7 DNA 2 ul 5ng/ul -171- -432 rGnRH DNA 2 ul 盖上盖，放入 45℃水浴×5min，插入冰内，开盖，再加入： 10×T4 噬菌体 DNA 连接酶缓冲液 1ul 5mM ATP 1ul T4 噬菌体 DNA 连接酶 1ul 指拨混匀，用离心机将管壁溶液甩至管底，16℃ 过夜。 实验结果