得到10ul的重组质粒,可用于转化大肠杆菌。 注意事项 1.当采用其它质粒和插入片段时,可以参照本实验采用的浓度和用量。鉴于不同长 度的插入片段、不同末端的载体和片段,两者的最终浓度在不同的实验室有各自的经验,浓 度会有一些变化,操作时可以参考 2.鉴于非中央空调实验室室温会随四季、昼夜波动,往往高于16℃。因此,16℃恒 温水浴通常放在4℃冷库(或4℃冰箱)之中。使用前须检查水浴槽中是否有充足的水及其 水温。 3.质粒选择的要求。质粒的选择主要依据实验目的决定。类似的实验不同公司往往 有大量的不同型号质粒可供选择,此时通常要考虑质粒上多克隆位点中是否有与插入片段相 匹配的限制性内切酶位点。我们建议购买前先征询有关经常使用类似质粒的专家的建议,采 用一些使用起来顺手且性能可靠的质粒。 4.插入片段的处理。当插入片段两端缺少与质粒相匹配的末端时,可以采用相应的 酶补平末端,形成钝端,使之可以与载体上的钝端相连接。由于载体钝端自身环化,使重组 成功率极大地下降,因此建议采用以下质粒的5去磷酸化处理,以减少载体的自身环化 提高重组的成功率 5.不同末端的插入片段和载体,重组的成功率不同。当载体两端为粘端而序列互补 时,或互为钝端时,载体便有可能自身环化,而自身环化是重组失败最常见的现象。因此, 为提高重组的成功率,可以选择适当的酶,切开质粒和插入片段,造成一侧为钝端、一侧为 粘端,或两侧粘端的序列不能互补,或两侧粘端3`、5伸出不一致:甚至修饰插入片段,比 如先补平插入片段两端,再选择插入片段一端独具的限制性内切酶处理,使之一端为平头(钝 端),另一端为粘端,等等。这样的处理可以提高重组的成功率。 6.质粒的5’去磷酸化。质粒酶切两端可以釆用 Calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP,小牛肠碱性磷酸酯酶)去磷酸化。方法是在酶切质粒之后,直接在反应体积中加 入1个单位的CIAP,混匀,温浴5分钟。具体温度为:质粒切口5’端凹陷进去的和钝端的 用50℃:质粒切口5’端突出的用37℃。 7.实验台安排。 8.酶的安全使用要求:随时插入-20℃冰盒或插入冰内,使用后立即放回-20℃冰箱 9.实验记录的要求,材料准备与实验方法分开,右上角注明年月日。实验报告的要 求,类于讲义的材料与方法,以及实验结果。要求详细准确。 10.实验的无菌概念要求。得到 10ul 的重组质粒，可用于转化大肠杆菌。 注意事项 1．当采用其它质粒和插入片段时，可以参照本实验采用的浓度和用量。鉴于不同长 度的插入片段、不同末端的载体和片段，两者的最终浓度在不同的实验室有各自的经验，浓 度会有一些变化，操作时可以参考。 2．鉴于非中央空调实验室室温会随四季、昼夜波动，往往高于 16℃。因此，16℃恒 温水浴通常放在 4℃冷库（或 4℃冰箱）之中。使用前须检查水浴槽中是否有充足的水及其 水温。 3．质粒选择的要求。质粒的选择主要依据实验目的决定。类似的实验不同公司往往 有大量的不同型号质粒可供选择，此时通常要考虑质粒上多克隆位点中是否有与插入片段相 匹配的限制性内切酶位点。我们建议购买前先征询有关经常使用类似质粒的专家的建议，采 用一些使用起来顺手且性能可靠的质粒。 4．插入片段的处理。当插入片段两端缺少与质粒相匹配的末端时，可以采用相应的 酶补平末端，形成钝端，使之可以与载体上的钝端相连接。由于载体钝端自身环化，使重组 成功率极大地下降，因此建议采用以下质粒的 5’去磷酸化处理，以减少载体的自身环化， 提高重组的成功率。 5．不同末端的插入片段和载体，重组的成功率不同。当载体两端为粘端而序列互补 时，或互为钝端时，载体便有可能自身环化，而自身环化是重组失败最常见的现象。因此， 为提高重组的成功率，可以选择适当的酶，切开质粒和插入片段，造成一侧为钝端、一侧为 粘端，或两侧粘端的序列不能互补，或两侧粘端 3’、5’伸出不一致；甚至修饰插入片段，比 如先补平插入片段两端，再选择插入片段一端独具的限制性内切酶处理，使之一端为平头（钝 端），另一端为粘端，等等。这样的处理可以提高重组的成功率。 6．质粒的 5’去磷酸化。质粒酶切两端可以采用 Calf intestinal alkaline phosphatase （CIAP，小牛肠碱性磷酸酯酶）去磷酸化。方法是在酶切质粒之后，直接在反应体积中加 入 1 个单位的 CIAP，混匀，温浴 5 分钟。具体温度为：质粒切口 5’端凹陷进去的和钝端的 用 50℃；质粒切口 5’端突出的用 37℃。 7．实验台安排。 8．酶的安全使用要求：随时插入-20℃冰盒或插入冰内，使用后立即放回-20℃冰箱。 9．实验记录的要求，材料准备与实验方法分开，右上角注明年月日。实验报告的要 求，类于讲义的材料与方法，以及实验结果。要求详细准确。 10．实验的无菌概念要求