。296· 北京科技大学学报 第31卷 表1紫金山金铜矿硫化铜矿化学元素分析（质量分数） Table I Chemical composition of Zijnshan secondary copper sulfide ore % Cu Fe SiO2 Al,03 K20 Na0 Mgo Cao As 065 243 260 59.99 10.84 0067 Q039 0.055 046 0038 12菌种及培养基 条件为：首先在95℃预变性2min,接着进行30个 实验所用细菌是从紫金山金铜矿疏化铜矿生物 循环的反应(95℃变性45s54C退火45s,72℃延 堆浸矿堆中分离筛选出来的.将筛选出来的细菌在 伸1minm),最后再在72C延伸5min.将所得PCR 含有硫化铜矿粉末（一43m)的液体9K培养基中 产物参照Muyzer等9的方法利用Bio-Rad公司的 多次转接培养，并添加硫酸铜驯化，使菌株具有较高 The DCodeTM Universal Mutation Detection System 的氧化活性及耐受铜离子能力.9K培养基的组成 进行电泳分离.聚丙烯酰胺凝胶质量分数为6%，其 如下(1L):3.0g(NH4)2S04,01gKCL,0.5g 中变性剂的质量分数从40%到80%(100%的变性 K2HP04,0.5gMgs04°7H20,0.01gCa(N03)2, 剂为7molL1的尿素和质量分数为40%的去离子 44.22gFeS047H20,稀疏酸调pH至2.0. 甲酰胺)，80V的电压下60℃电泳10h,电泳完毕后 1.3不同温度下细菌的生长及氧化活性测定 将凝胶在EB中染色l5min.在紫外灯下切除 在250mL锥形瓶中加入90mL的9K培养基 DGGE(变性梯度凝胶电泳)条带，洗净后浸泡于 和10mL的接种液，用稀硫酸溶液调pH至2.0.分 50L无菌去离子水中24h以上，取2L进行PCR 别在7,10,15,20,25,30,35和40℃的摇床上培养， 扩增，扩增产物经DGGE确认为单一条带后，送交 摇床转速160rmin1,每隔24h测定培养液中的细 北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序. 菌浓度和剩余F+离子浓度，当细菌浓度不再变化 1.6分析方法 时，计数细菌浓度，计算Fe+氧化为Fe3+的氧化率. 溶液中F€2浓度用重铬酸钾法测定，采用质量 细菌计数采用血球计数板在生物相差显微镜下观 分数为2%的二苯胺磺酸钠作为指示剂.溶液pH 察. 值用Thermo Orion Model868电位pH计测定.浸 1.4不同温度下浸出实验 出液中的其他金属离子浓度用原子吸收法测定.上 在250mL锥形瓶中加入90mL的9K培养基 海正阳仪表厂UJ34D型直流电位差计用于测定氧 和10mL的接种液，并加入10g硫化铜矿粉末，用 化还原电位的变化. 稀硫酸溶液调pH至20.分别在7,10,15.20,25， 2实验结果及分析 30,35和40℃的摇床上培养.摇床转速 160rmin,每隔24h测定培养液中的氧化还原电 2.1温度对浸矿微生物活性的影响 位及铜离子浓度，当氧化还原电位不再变化时分析 温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结 浸渣中铜离子含量，计算铜的浸出率 构与功能以及细胞结构如细胞膜的流动性及完整性 15不同温度下微生物菌群分析 来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢.过高的环 将15℃和30℃浸出结束后的浸出液进行显微 境温度会导致蛋白质或核酸的变性失活，而过低的 镜观察，并做SEM分析，观察两种温度下细菌的形 温度会使酶活力受到抑制，细胞的新陈代谢活动减 态差异.为了了解浸出液中两种温度下细菌的种群 弱.本实验研究了分离的浸矿微生物在不同温度梯 差异，将浸出液离心，参考Oved等可的方法提取 度条件下培养的生长过程，通过检测其对培养基中 DNA.以引物358FGC(5'-CCTACGGGAG- Fe2+氧化为Fe3+的变化，获得温度对实验细菌生长 GCAGCAG-3)907R(5-CCGTCAATTCMTTT- 和氧化活性的影响规律，结果见表2.结果表明，实 GAGTTT-3)扩增细菌的16 S rDNA,在正向引物 验细菌可在7~40℃间存活，最适温度为30℃. 前加有富含GC的40个碱基(CCCCCCGCCCG- 2.2温度对铜浸出率的影响 CGCCCCGGGCGGGGCGGGCGCACGCGCGG)17 经过10d的浸出，浸出环境温度对铜浸出率的 PCR反应体系为100L:20L5倍GoTaq缓冲液， 影响实验结果见表3. 6gL 25 mmol'L MgCk,2L 10mmol'L dNTP. 从表3可以看出，浸出温度是影响细菌浸铜速 两种引物分别为1L,模板DNA2L,Promega 率的关键因素，温度为30℃时铜浸出率最高，高于 GoTg聚合酶0.5L.去离子水67.5L.PCR反应 30℃或低于30℃时铜浸出率都要降低.从表中还表 1 紫金山金铜矿硫化铜矿化学元素分析( 质量分数) Tabl e 1 Chemi cal composition of Zijinshan secondary copper sulfide ore % Cu Fe S S iO2 Al 2O3 K2O Na2O MgO CaO As 0.65 2.43 2.60 59.99 10.84 0.067 0.039 0.055 0.46 0.038 1.2 菌种及培养基 实验所用细菌是从紫金山金铜矿硫化铜矿生物 堆浸矿堆中分离筛选出来的.将筛选出来的细菌在 含有硫化铜矿粉末( -43 μm) 的液体 9 K 培养基中 多次转接培养, 并添加硫酸铜驯化, 使菌株具有较高 的氧化活性及耐受铜离子能力 .9 K 培养基的组成 如下( 1 L ) :3.0 g ( NH4 ) 2SO4, 0.1 g KCl, 0.5 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4 ·7H2O, 0.01 g Ca ( NO3 ) 2, 44.22g FeSO4·7H2O, 稀硫酸调 pH 至 2.0 . 1.3 不同温度下细菌的生长及氧化活性测定 在 250 mL 锥形瓶中加入 90 mL 的 9 K 培养基 和 10 mL 的接种液, 用稀硫酸溶液调 pH 至 2.0 .分 别在 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35 和 40 ℃的摇床上培养, 摇床转速160 r·min -1 , 每隔 24 h 测定培养液中的细 菌浓度和剩余 Fe 2+离子浓度, 当细菌浓度不再变化 时, 计数细菌浓度, 计算Fe 2+氧化为Fe 3 +的氧化率 . 细菌计数采用血球计数板在生物相差显微镜下观 察. 1.4 不同温度下浸出实验 在 250 mL 锥形瓶中加入 90 mL 的 9 K 培养基 和10 mL 的接种液, 并加入 10 g 硫化铜矿粉末, 用 稀硫酸溶液调 pH 至 2.0 .分别在 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35 和 40 ℃ 的 摇 床 上 培 养, 摇 床 转 速 160 r·min -1 , 每隔 24 h 测定培养液中的氧化还原电 位及铜离子浓度, 当氧化还原电位不再变化时分析 浸渣中铜离子含量, 计算铜的浸出率. 1.5 不同温度下微生物菌群分析 将 15 ℃和 30 ℃浸出结束后的浸出液进行显微 镜观察, 并做 SEM 分析, 观察两种温度下细菌的形 态差异.为了了解浸出液中两种温度下细菌的种群 差异, 将浸出液离心, 参考 Oved 等 [ 6] 的方法提取 DNA .以 引 物 358FGC ( 5′-CC TACGGGAG￾GCAGCAG-3′) 和 907R( 5′-CCGTCAATTCM TTT￾GAGTTT-3′) 扩增细菌的 16S rDNA, 在正向引物 前加有富含 GC 的 40 个碱基( CGCCCGGGGCG￾CGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG ) [ 7] . PCR 反应体系为 100 μL :20 μL 5 倍 GoTaq 缓冲液, 6μL 25 mmol·L -1 M gCl2, 2μL 10 mmol·L -1 dNTP, 两种引物分别为 1 μL, 模板 DNA 2 μL, Promeg a GoTaq 聚合酶 0.5 μL, 去离子水 67.5 μL .PCR 反应 条件为:首先在 95 ℃预变性 2 min, 接着进行 30 个 循环的反应( 95 ℃变性 45 s, 54 ℃退火 45 s, 72 ℃延 伸 1 min) , 最后再在 72 ℃延伸 5 min .将所得 PCR 产物参照 Muyzer 等 [ 8] 的方法利用 Bio-Rad 公司的 The DCode TM Universal M utation Detectio n Sy stem 进行电泳分离.聚丙烯酰胺凝胶质量分数为6 %, 其 中变性剂的质量分数从 40 %到 80 %( 100 %的变性 剂为 7 mol·L -1的尿素和质量分数为 40 %的去离子 甲酰胺) , 80 V 的电压下 60 ℃电泳 10 h, 电泳完毕后 将凝胶在 EB 中染色 15 min .在 紫外灯下切除 DGGE( 变性梯度凝胶电泳) 条带, 洗净后浸泡于 50 μL无菌去离子水中 24 h 以上, 取 2 μL 进行 PCR 扩增, 扩增产物经 DGGE 确认为单一条带后, 送交 北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序. 1.6 分析方法 溶液中 Fe 2+浓度用重铬酸钾法测定, 采用质量 分数为 2 %的二苯胺磺酸钠作为指示剂.溶液 pH 值用 Thermo Orion M odel 868 电位 pH 计测定 .浸 出液中的其他金属离子浓度用原子吸收法测定.上 海正阳仪表厂 UJ34D 型直流电位差计用于测定氧 化还原电位的变化 . 2 实验结果及分析 2.1 温度对浸矿微生物活性的影响 温度通过影响蛋白质 、核酸等生物大分子的结 构与功能以及细胞结构如细胞膜的流动性及完整性 来影响微生物的生长 、繁殖和新陈代谢 .过高的环 境温度会导致蛋白质或核酸的变性失活, 而过低的 温度会使酶活力受到抑制, 细胞的新陈代谢活动减 弱 .本实验研究了分离的浸矿微生物在不同温度梯 度条件下培养的生长过程, 通过检测其对培养基中 Fe 2+氧化为 Fe 3 +的变化, 获得温度对实验细菌生长 和氧化活性的影响规律, 结果见表 2 .结果表明, 实 验细菌可在 7 ～ 40 ℃间存活, 最适温度为 30 ℃. 2.2 温度对铜浸出率的影响 经过 10 d 的浸出, 浸出环境温度对铜浸出率的 影响实验结果见表 3 . 从表 3 可以看出, 浸出温度是影响细菌浸铜速 率的关键因素, 温度为 30 ℃时铜浸出率最高, 高于 30 ℃或低于30 ℃时铜浸出率都要降低 .从表中还 · 296 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 31 卷